宋颖芳，洪景芳，柳德灵，林庆安，赖国祥

(南京军区福州总医院1.呼吸与危重症医学科、2.神经外科，福建福州 350025)

核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一种具有多向调节作用的核转录因子。大量临床实验研究均证实NF-κB蛋白在哮喘患者气道中被过度活化［1］。作为哮喘发病机制中最受关注的信号转导系统之一，其作用渗透气道重塑机制的多个环节。1，25-二羟维生素D3［1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-(OH)2D3］是体内VitD最重要的活性代谢产物。既往研究均侧重于1，25-(OH)2D3调控哮喘免疫应答及慢性气道炎症反应［2－3］，但对于其在哮喘气道重塑的作用及机制未予更多研究阐释。本课题组前期研究首次发现1，25-(OH)2D3能抑制哮喘状态下作为气道重塑结构基础的气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的高增殖状态及表型改变［4］。Ramirez等［5］的研究发现 1，25-(OH)2D3能抑制气道上皮细胞及成纤维细胞中转化生长因子-β诱导的促纤维化作用及上皮-间质转化。此外，新近的流行病学调查研究还证实机体的VitD水平与肺功能呈正相关［6］，这些研究结果强烈提示了1，25-(OH)2D3在哮喘气道重塑中的可能作用。本实验建立慢性哮喘小鼠气道重塑模型，直接观察1，25-(OH)2D3对哮喘小鼠气道重塑的影响，进一步探讨这种抑制效果是否通过1，25-(OH)2D3对NF-κB信号通路的调控起作用。

1 材料与方法

1.1 材料 卵白蛋白(ovalbumin，OVA)、氢氧化铝及1，25-(OH)2D3(美国 Sigma公司);抗 NF-κB p65、抗IκBα和抗p-IκBα多克隆抗体及ECL发光试剂盒(美国Santa Cruz公司)，NE-PERTM试剂盒(美国Pierce公司);TRIzol试剂(美国Invitrogen公司);反转录RT试剂盒(美国Promega公司);Fast-Start SYBR GreenⅠ试剂盒(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及哮喘模型的建立 清洁级8～10周龄BALB/c小鼠18只，♂，体质量17～21 g，购自第四军医大学动物实验中心。小鼠于动物房(环境温度25℃，湿度70%)经适应性饲养1周后按随机数字表法随机分为对照组、哮喘组及VitD组，每组6只。参照文献方法［7］建立哮喘模型并加以改进，哮喘组小鼠于实验开始d 1、8、15给予腹腔注射200 μl致敏液(OVA 50 μg，氢氧化铝凝胶5 mg)，从d 22开始为激发阶段，麻醉状态下鼻腔滴入1% OVA溶液50 μl，每天1次，连续1周，而后每周3次，连续8周。VitD组致敏及激发方法同哮喘组并参照文献［8］的剂量在每次OVA激发前1 h予以腹腔注射100 ng 1，25-(OH)2D3;对照组用等量生理盐水代替OVA进行致敏和激发。末次激发后24 h处死小鼠。迅速取出左肺下叶用4%多聚甲醛固定并石蜡包埋，切片(厚4 μm)。右肺经液氮冷冻后，置于－70℃冻存，用于总RNA及总蛋白抽提。

1.2.2 肺组织病理分析 石腊切片分别进行HE染色及Masson三色染色，200×光镜下每个切片随机采集至少10个150～250 μm直径的完整支气管横断面，图像分析软件测定支气管基底膜周径(Pbm)、上皮层面积(WAmuc)、平滑肌层面积(WAm)、平滑肌细胞核数(N)及蓝色胶原在气管基底膜下20 μm的分布面积(Wco1)，并用Pbm标化。

1.2.3 Western blot法检测NF-κB p65、IκBα和p-IκBα的蛋白表达 使用NE-PERTM试剂盒提取肺组织总蛋白及胞质蛋白、胞核蛋白。10%SDSPAGE分离总蛋白并电转移至硝酸纤维素膜上，1∶1 000稀释的抗NF-κB p65、IκBα和p-IκBα抗体分别进行蛋白印记分析，ECL化学发光试剂盒显像，凝胶图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，并以β肌动蛋白(β-actin)为内参标化各样品蛋白电泳条带的灰度值。用同样方法再次检测各组肺组织胞核蛋白及胞质蛋白中NF-κB p65的蛋白表达，并计算NF-κB p65蛋白的胞核表达率(胞核表达量/总蛋白表达量)及胞质表达率(胞质表达量/总蛋白表达量)。

1.2.4 实时荧光定量RT-PCR检测IκBα的mRNA表达 采用TRIzol试剂提取肺组织总RNA并逆转录为cDNA，而后取2 μl cDNA作为反应模板进行PCR扩增。IκBα序列:上游 5'-CCGCACAGCCATGTTTCAG-3'，下游 5'-CATGGAGTCCAGGCCGCTGTCGTG-3'，产物长度125 bp;GAPDH序列:上游5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，下游5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'，产物长度191 bp。PCR反应条件:IκBα(94℃ 45 s，60℃ 1 min，72℃ 90 s，共30个循环);GAPDH(94℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，共30个循环)。反应结束后，记录每个样品管中的荧光强度增加到荧光阈值所对应的扩增循环数(Ct)值。以GAPDH为内参照，计算目的基因mRNA的相对含量［目的基因mRNA/GAPDH mRNA= 2－△Ct(△Ct=Cttarget-CtGAPDH)］。

2 结果

2.1 肺组织病理学改变及图像分析 与对照组相比，哮喘组小鼠气道壁及气道平滑肌层明显增厚，黏膜下水肿，黏膜下层增宽，黏膜皱褶增多，管腔狭窄，有时可见黏液栓堵塞，气道上皮细胞脱落，黏膜下层及管周有大量炎性细胞浸润，而1，25-(OH)2D3的干预减轻了上述病变(Fig 1)。

Fig 1 1，25-(OH)2D3treatment attenuates established airway remodeling in a murine model of chronic asthma (HE×400)

图像分析软件显示哮喘组支气管壁上皮层面积(WAmuc/Pbm)、平滑肌层面积(WAm/Pbm)、胶原沉积面积(Wcol/Pbm)及平滑肌细胞核数量(N/ Pbm)均明显高于对照组，而VitD组均较哮喘组明显下降，但仍高于对照组(P＜0.05)，见Tab 1。

Tab 1 Morphometric analysis of airway wall thickness(±s，n=6)

Tab 1 Morphometric analysis of airway wall thickness(±s，n=6)

#P＜0.05 vs the control group;△P＜0.05 vs the asthma group

Group WAmuc/Pbm/ μm2·μm－1 WAm/Pbm/ μm2·μm－1 Wcol/Pbm/ μm2·μm－1 N/Pbm/number· 100 μm －1 Control 7.14±0.51 2.43±0.51 8.37±0.87 1.37±0.31 Asthma 21.57±0.74# 7.18±1.13# 16.73±1.41# 5.02±0.23# VitD 15.33±0.37#△ 4.35±0.97#△10.75±1.14#△ 3.84±0.27#△

Fig 2 1，25-(OH)2D3prevents the nuclear translocation of NF-κB p65 in a murine model of chronic asthma

2.2 肺组织NF-κB p65蛋白的表达及核移位情况VitD组NF-κB p65总蛋白表达量(0.48±0.06)较哮喘组(0.71±0.08)明显降低(n=6，P＜0.05)，但仍高于对照组(0.31±0.04)(n=6，P＜0.05)，即1，25-(OH)2D3能抑制哮喘肺组织中的NF-κB p65总蛋白表达(Fig 2)。进一步比较NF-κB p65蛋白在胞质及胞核的分布情况，可见VitD组NF-κB p65的胞核表达率为(0.59±0.12)，明显低于哮喘组(0.78±0.09)(n= 6，P＜0.01)，相应地，VitD组NF-κB p65的胞质表达率(0.41±0.07)较哮喘组(0.22±0.04)明显增高(n=6，P＜0.01)，说明1，25-(OH)2D3明显减少了哮喘肺组织中NF-κB p65在胞核中的聚集而相应地增加了其在胞质中的表达，即阻止了哮喘肺组织中NF-κB p65的核移位。

2.3 肺组织IκBα的表达及其磷酸化水平 VitD组IκBα蛋白表达量(0.32±0.04)较哮喘组(0.21 ±0.03)明显增高，但两者均低于对照组(0.46± 0.05)(n=6，P＜0.01)，由此可见1，25-(OH)2D3能上调哮喘状态下的IκBα蛋白表达(Fig 3)。

Fig 3 1，25-(OH)2D3increases the IκBα protein level but decreases its phosphorylation in a murine model of chronic asthma

与蛋白表达结果变化情况相一致，VitD组IκBα mRNA的相对含量(0.33±0.04)明显高于哮喘组(0.15±0.02)，但两者均低于对照组(0.53±0.03) (n=6，P＜0.01)。因此1，25-(OH)2D3能明显上调哮喘肺组织中IκBα的mRNA表达，这是其上调IκBα蛋白表达的主要原因。

IκBα蛋白的降解是影响IκBα蛋白表达的另一重要原因。而磷酸化是IκBα蛋白降解的先决条件。结果显示(Fig 3)，1，25-(OH)2D3能抑制哮喘肺组织中的p-IκBα蛋白表达。为排除IκBα的表达水平对p-IκBα表达的影响，实验用IκBα蛋白表达量对p-IκBα蛋白表达量进行标化，结果可见，VitD组p-IκBα/IκBα为(0.41±0.05)，亦明显低于哮喘组的(0.86±0.04)(n=6，P＜0.05)，但仍高于对照组的(0.17±0.03)(n=6，P＜0.01)。由此可见1，25-(OH)2D3能通过抑制IκBα的磷酸化来抑制IκBα的蛋白降解，这是1，25-(OH)2D3上调IκBα蛋白表达的另一重要原因。

3 讨论

近年来气道重塑已经成为哮喘研究的热点，它不仅是哮喘慢性化、持续化、严重化的病理基础，而且也是重症哮喘、难治性哮喘和激素抵抗性哮喘的病理基础。既往研究表明给予致敏小鼠进行慢性长时程激发可以诱导出具有人类哮喘病理特征的哮喘动物模型［9］。本实验给予致敏小鼠1%的OVA滴鼻激发9周，结果发现小鼠肺组织存在明显的炎性细胞浸润，并出现明显的结构改变，包括气道壁上皮层增厚、上皮下胶原沉积及平滑肌层增厚等。说明该动物模型发生了哮喘特异性的气道炎症和气道重塑，慢性哮喘小鼠模型复制成功。

糖皮质激素作为目前哮喘治疗的一线用药，已成为现代哮喘治疗的基石，它虽能有效调节哮喘慢性炎症和免疫紊乱，但对哮喘气道重塑意义有限［10］。研究证实只有长期且大剂量地运用激素才能改善业已形成的气道重塑改变，但这样的激素治疗会引起较多的全身性不良反应，限制了它在哮喘气道重塑治疗中的临床应用［11－12］。其余的哮喘常用治疗药物，如白三烯拮抗剂、长短效β受体激动剂和IgE单克隆抗体等对哮喘气道重塑的治疗作用到目前为止均未得到满意的结果［10］。因此寻找更安全更有效的药物成为研究治疗哮喘气道重塑的关键。

本研究结果发现1，25-(OH)2D3的运用能有效减轻慢性哮喘气道重塑的程度，这一结果从新的角度诠释了1，25-(OH)2D3在哮喘防治中的作用，有力地展示了1，25-(OH)2D3潜在的改善肺功能和气道重塑的能力。由于1，25-(OH)2D3的结构、作用方式及其生成时的严密负反馈调节机制与类固醇激素非常相似，因此它不仅是脂溶性维生素，更被公认为第二甾体类激素。在现有对哮喘发病机制的研究中，1，25-(OH)2D3已被证实能调节慢性气道炎症及紊乱的免疫应答，这与激素对哮喘的作用机制亦相类似［2－3］。此外，它还被推荐为临床治疗激素抵抗型哮喘的重要辅助药物［13］。鉴于1，25-(OH)2D3是一种生物制剂，副作用小且使用依从性好，加之上述提及的在哮喘防治中与类固醇激素诸多的相似作用，1，25-(OH)2D3理所当然将会成为哮喘气道重塑治疗药物的一个良好的候选标靶。

1，25-(OH)2D3主要通过与其受体VDR的结合发挥生物学效应。而VDR被认为是NF-κB活性调控的重要上游分子［14－15］。现已发现1，25-(OH)2D3能通过与VDR的配体受体效应来抑制NF-κB信号通路进而调节多种体内外的生物学效应［16－17］。本实验进一步将1，25-(OH)2D3对NF-κB活性的这种抑制作用扩展到了哮喘肺组织中。结果发现1，25-(OH)2D3能通过增加哮喘肺组织中IκBα的mRNA表达及减少其磷酸化这两种途径来上调IκBα的蛋白表达，进而有效地抑制哮喘肺组织中NF-κB p65的核移位，发挥抑制NF-κB活性的作用。

鉴于NF-κB信号通路是哮喘气道重塑的关键环节，有理由认为1，25-(OH)2D3抑制哮喘肺组织中的NF-κB活化可能是其调节哮喘气道重塑的重要作用机制。当然，NF-κB通路同时也是调控哮喘免疫和气道炎症反应的关键性调控因子，因此1，25-(OH)2D3对哮喘肺组织NF-κB活化的抑制作用也为其已明确的对哮喘的免疫调节和抗炎作用提供了理论依据。此外，新近流行病学研究发现补充维生素D水平能明显减轻哮喘严重程度并有效改善激素治疗反应［18］。而NF-κB持续性过度激活不仅是重度哮喘的重要特征，同时也是影响激素临床疗效的重要原因［19］。故除外已知的1，25-(OH)2D3能提高CD4+T细胞在地塞米松作用下分泌IL-10的能力［13］，本实验证实的1，25-(OH)2D3抑制哮喘NF-κB活化亦为上述流行病学结果提供了一个可能的合理性解释。

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