郭春，林蕾，任妮妮，姜轲冉，袁海霞，余旭平

浙江大学动物科学学院 农业部动物病毒学重点实验室，浙江 杭州 310058

基因敲除是后基因组时代基因功能研究的最有效手段之一，而载体是基因敲除工作的工具和核心[1]。2010年李军华等[2]以pBS246质粒为骨架，在该质粒的两个LoxP序列之间插入正筛选标记基因，并在两个LoxP序列外侧分别插入两组携带“8 碱基”酶切位点的多克隆位点序列(MCS-1和MCS-2) 和负筛选标记基因，成功构建了通用型基因打靶载体 pGT-V1，该载体的构建为有效开展基因打靶提供了新的平台。同年姜娜等[3]通过构建打靶载体pHY-Kan-ssaV，成功敲除了伤寒沙门氏菌S.ty2的ssaV基因，获得伤寒沙门氏菌 ssaV基因缺失株。基因缺失株的构建是研究病原微生物致病机理的重要手段[4]，通过构建致病菌的基因缺失株并分析其表型[5]，有助于快速了解致病基因功能和致病机制。2007年乔凤等[6]在pUC19质粒的基础上，在其多克隆位点处插入卡那霉素抗性基因，并在该基因两侧添加多个酶切位点，成功构建了pUC19K质粒。作者进一步利用该自杀质粒构建了布鲁氏菌外膜蛋白 Omp25基因突变株，为细菌基因功能研究奠定基础。2011年胡勇等[7]以pMD18-T为载体，利用交错PCR技术构建了伤寒沙门氏菌bcfD基因敲除突变株，为进一步研究 bcfD的基因功能提供有效的技术手段。

基因敲除方法很多，插入复制突变法(Insertion duplication mutation，IDM) 是其中一种简单高效的基因敲除和基因功能研究方法[8-9]。IDM是利用克隆于载体中的DNA片段与基因组中的相应基因同源重组，插入另一拷贝DNA片段和质粒骨架，导致重组菌中相应基因被截断而敲除。……