邢 进，吴 军，岳秉飞，贺争鸣

（1.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；2.中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京100050）

绿脓杆菌又称铜绿假单胞菌，革兰氏阴性杆菌，广泛存在于环境（如水、土壤）、植物和动物中［1］。绿脓杆菌是医院最常见机会致病菌之一［2］，也是无特定病原体（SPF）动物必须排除的病原菌之一。在免疫功能正常的小鼠体内，绿脓杆菌不会致病，但是对免疫功能低下的动物，如注射免疫抑制剂、烧伤研究和全身辐照等，以及免疫缺陷动物模型，就很容易受到感染而出现败血症，导致死亡［3、4］，严重干扰动物实验的进行，影响实验数据和结果的可靠性和准确性。因此，了解和掌握绿脓杆菌在实验动物和实验动物设施中绿脓杆菌的分型情况，有助于控制该菌在实验动物中的传播和对动物实验的影响。本实验采用多位点可变数目串联重复序列分析（multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis，MLVA）方法对近几年在实验动物中分离到的141株绿脓杆菌分离株进行分型研究。

1 材料和方法

1.1 绿脓杆菌菌株

标准菌种ATCC 27853和PAO1株ATCC 47085，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。分离株共141株，编号为Pa1～Pa143（Pa73和Pa129为空号）分离自17个不同的实验动物生产和使用单位（分别编号为L1～L17）。其中133株分离自北京地区实验动物生产和使用单位中小鼠、大鼠、豚鼠和兔；2株分离自河北省的小鼠；6株分离自北京地区部分实验动物设施中的饮水样品。

1.2 主要试剂和仪器

MH琼脂培养基购自BD公司；PCR相关试剂购自TAKARA生物工程公司；根据参考文献［5］合成引物ms77，ms127，ms142，ms172，ms211，ms212，ms213，ms214，ms215，ms216，ms217，ms222，ms223，由上海生物工程公司合成。毛细管电泳仪（Qiagen QIAxcel），BioNumerics软件6.6版本。

1.3 绿脓杆菌DNA的制备

将绿脓杆菌分离株接种于MH培养基37℃培养18 h，用灭菌棉签取适量菌落悬浮于无菌PBS中，采用加热法提取菌落DNA，-20℃保存备用。

1.4 多位点串联重复序列（MLVA）分析

根据文献［5，6］和MLVA数据库［7］，筛选13个串联重复基因位点，见表1，对141株绿脓杆菌分离株和2株标准菌种的13个VNTR位点进行MLVA分析。

1.4.1 PCR反应体系 20μL反应体系：上下游引物（10μmol/L）各0.6μL，DNA模版0.5μL，dNTP （各2.5mmol/L）1.6μL，Taq酶（5 U/μL）0.2μL，10×Buffer（含Mg2+15 mmol/L）2μL，加灭菌水至20μL。

1.4.2 反应条件96℃预变性5 m in，95℃30 s，65℃30 s，72℃1 m in 30个循环，72℃延伸10 m in。

1.4.3 毛细管电泳使用高分辨力预制胶卡（QX DNA High Resolution Cartidge）电泳12 min，Size Marker使用100 bp～3 kb，A linement Marker使用50 bp～3 kb。

1.5 MLVA结果分析

13个位点可变数目重复序列（VNTR13）分析PCR产物经毛细管电泳，所得电泳图用Biocalculator软件进行图像处理，然后用Bionumerics 6.6软件进行分析，计算各VNTR数目，根据该特征数据，对各菌株间的相似度采用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，绘制系统发育树（UPGMA dendrogram），并绘制最小生成树（minimum spanning tree，MST）。MLVA的分辨力用辛普森多样性系数D（Simpson’s index of diversity）表示［8］，公式如下：注：N表示全部受试菌株的总数，nj表示菌株的分型数目。

2 结果

2.1 绿脓杆菌分离株MLVA的稳定性和重复性

每次进行PCR均设标准菌株的对照，扩增片段大小或重复序列数与文献和数据库中的一致［5，7］。从分离株中抽取不同来源的20株菌，间隔1个月重复扩增3次，每次的扩增片段或重复序列数完全相同。

2.2 绿脓杆菌VNTR13多态性

本次试验选取了13个VNTR位点对141株北京地区的实验动物绿脓杆菌分离株进行MLVA基因分型，如两个标准菌株的电泳结果所示，如图1、图2所示。显示出绿脓杆菌VNTR13的DNA指纹图谱多态性。

2.3 聚类分析

表1 绿脓杆菌13个VNTR位点引物序列及重复片段大小［5］Tab.1 P.Aeruginosa 13 VNTRs loci primer sequences and repeat fragment size

图1 PAO1株VNTR13的多态性Fig.1 Polymorphism of PAO1 strain VNTR13 Note：1，6，11，17.50bp DNA ladder marker；2～5.ms77，ms127，ms142，ms172；7～10.ms211，ms212，ms213，ms214；12～16.ms215，ms216，ms217，ms222，ms223.

图2 ATCC27853 VNTR13的多态性Fig.2 Polymorphism of ATCC27853 strain VNTR13 Note：1，6，11，17.50bp DNA ladder marker；2～5.ms77，ms127，ms142，ms172；7～10.ms211，ms212，ms213，ms214；12～16.ms215，ms216，ms217，ms222，ms223.

2.3.1 VNTR13扩增各菌株的片段经过毛细管电泳仪电泳，图像经Bionumerics6.6数据化处理分析后计算出各菌株的每个位点的重复序列数目。根据每株菌的13个重复序列数将143株（含ATCC27853和PAO1株）绿脓杆菌相同基因型合并，绘制精简的系统发育树，见图3。来自17个单位的141株绿脓杆菌分离株，共被分为A、B、C 3个大群56个基因型，基因型编号为MP1～56，见表2。根据公式计算VNTR13的分辨力系数为D=0.763。

表2 141株绿脓杆菌分离株分型情况Tab.2 The number of 141 P.aeruginosa isolates typing

图3 北京地区绿脓杆菌MLVA分型结果聚类分析Fig.3 MLVA typing of P.aeruginosa in Beijing cluster analysis results注：143株绿脓杆菌（含ATCC27853和PAO1株）共分为A、B、C三个大群，56个基因型。图片右侧的菌株信息从左至右依次为：MLVA分型编号，同型菌株数量，随后13列分别为VNTR位点ms77、ms127、ms142、ms172、ms211、ms212、ms213、ms214、ms215、ms216、ms217、ms222、ms223的重复序列数目。ATCC 27853和PAO1株作为分型对照Note：143 P.aeruginosa（including ATCC27853 and PAO1 strain）were divided into A，B，C three large group，56 genotypes.Strains right of the picture information from left to right：MLVA type number，the number of the same type of strain，respectively，followed by 13 locims77，ms127，ms142，ms172，ms211，ms212，ms213，ms214，ms215，ms216，ms217，ms222，ms223 number of repeat sequences.ATCC 27853 and PAO1 strains as a sub-type controls

2.4.2 用最小生成树对所得菌株VNTR13特征数据进行聚类分析（彩插7见图4）。从图中可以看到所有菌株被分为了3大部分。其中A群所占比例最大，为116/141（82.3％），B群为18/141 （12.8％），C群为7/141（5.0％）。A群主要由L1～L3、L10～L15共9个来源的分离菌组成。B群主要由L2、L3、L5、L6、L15和L16共6个来源的分离菌组成。C群主要由L2～L4、L7～L9和L14共7个来源的分离菌组成。标准菌株PAO1归属于C群，ATCC27853属于A群，但同源关系较远。A群中以MP9和MP10分型为主。其他菌株均呈散在分布。

在141株分离株中，Pa71～Pa77（Pa73为空号）是不同来源动物饮水样品，分型编号为MP20～MP25，在3个群中均有分布，MP20、MP21属于B群，MP23、MP24属于C群，MP25属于A群。

Pa142和Pa143（MLVA分型编号MP51）分离自L17，为河北省石家庄市，其同源性与Pa123（分型编号MP44），同源性高达85.9％。

Pa015～021、024～030、033～043、046～052、056～057、060～067、080、085、088～089、092～097、108～120、124～127，分别分离自L2、L12和L13，分离株数最多，分型完全相同。Pa023和Pa099分离自两个不同的单位，L2和L14，分型完全相同，分型编号为MP12。其他分离地点的分离株分型相对独立，无区域性同源关系。

3 讨论

绿脓杆菌的基因分型方法主要有MLVA方法、脉冲场电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）方法［9，10，11］，以及多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）方法等［12］。与后两者相比，MLVA分型方法在分性能力、试验效率、自动化程度、重复性和成本等因素都是比较理想的分型方法［12，13］。本研究中所得到的56种基因分型通过与数据库［7］比对，其中MP49（Pa133）和MP55（Pa139）分别与利比亚的1株和西班牙的1株分离株仅有2个位点的不同，同源性最高；其次是MP5（Pa005）、MP25（Pa077）、MP38（Pa104）和MP41（Pa107）分别与分离自法国的4株菌株有3个位点的差异；MP54 （Pa137～138、140）与分离自西班牙的1株分离株有3个位点的差异。其他分型与数据库中比对的结果，位点差异均在3个以上。本研究的MLVA结果已经上传至此数据库，名称为P.aeruginosa2011_ Beijing。由此可以将所得的重复序列数目结果共享，与国内外的分离株进行比对，对于病原菌流行病学分析具有很好的应用价值。

目前国内还没有应用MLVA方法对实验动物中绿脓杆菌分型的报道，MLVA基因分型方法日渐成熟，近两年已经有很多关于大肠杆菌［14］、布鲁氏菌［15］、鼠疫耶尔森氏菌［16］、烟曲霉菌［17］等病原菌的MLVA方法分型的报道。在绿脓杆菌的分型分析中，一般常用的有15个VNTR位点，本次实验所选择的13个位点的重复序列大小均在15 bp以上，不需要进行测序就能够测定其片段大小。

根据最小生成树（MST）的结果可以发现，北京地区的绿脓杆菌分离株主要分为3个大群，其中A群的比例最大，占到了82.3％，B群占12.8％，C群占5.0％。A群基因型中MP9有11株，MP10有69株，这与不同来源动物的检测数量有一定关系。在菌株来源中，L2中的分离菌株在3个群中均有分布，表明此单位的绿脓杆菌污染源来自于不同方面。总体分析，其他各来源分离株基本呈现散在分布，大多为一株一型，表明北京地区动物设施内的绿脓杆菌分离株多态性比较丰富。因此更需要我们引起对该菌的重视。

本次试验中水中分离株与动物分离株分型并不完全相同，只是具备较近的同源关系，能够证明饮水的污染是实验动物绿脓杆菌感染的重要原因之一。大部分分离株保持了比较独立的基因型，而L3的分离株呈明显散在分布，这可能与动物使用单位不繁殖动物，所用实验动物均从外部购买有关。实验动物设施是相对封闭的环境，同时都有着比较严格的净化措施，从结果看，同一区域的分离株并没有较近的同源性，反倒是不同区域的分离株存在一定的同源性。说明实验动物的引进和交流会引起绿脓杆菌对本实验室或实验动物设施的污染。由此可见，通过MLVA方法可以方便的对本实验室和动物设施的绿脓杆菌污染进行分子流行病学的临床监测，追溯污染源，便于实验室的评价。

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