廉 虹，马元武，刘 宁，全雄志，张连峰

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

肾素-血管紧张素系统 （renin-angiotensin system，RAS）是控制血压和和体内电解质平衡经典的调节系统。2002年，Nguyen等［1］利用重组的带有放射性标记的人源肾素，在人类肾脏cDNA库中筛选出了一个与以往发现的任何膜受体蛋白均无同源性的受体蛋白，即肾素（原）受体［（p）RR］。（p） RR是一种小分子量蛋白，含有350个氨基酸，分子量35～39×103，由大段的细胞外（EC）部分，单次跨膜区（TM）和一个短的细胞内（IC）部分组成。由于肾素（原）受体最初发现是与V-ATPase（囊泡H+-ATPase）偶联，所以编码此蛋白的基因被命名为ATP6ap2（ATPase 6 accessory protein2）［2，3］。

（p）RR在人体内广泛表达：其中在心脏、脑、胎盘中表达最多，在肝、肾脏和胰腺中表达次之，在肺和骨骼肌组织也有少量表达。序列比对分析显示，（p）RR在各物种间的同源性非常高，人的（p）RR与大鼠、小鼠、鸡、青蛙和斑马鱼等均具有较高同源性［4］，推测这个基因在生命体中具有重要的功能。在人类此基因存在于X染色体上。至今，已经发现了两种与（p）RR相关的疾病，一种是该基因的4号外显子的剪切增强子发生321位C〉T的沉默突变引起神经系统智力缺陷、癫痫和共济失调等病症［5］；第二种是（p）RR基因多态性的（IVS）5+169C〉T （rs5918007）基因型与人类高血压相关［6，7］。

（p）RR敲除会导致胚胎致死，这很大程度的限制了研究者的研究进程。随后，Celine A等［8］构建了血管平滑肌细胞（VSMC）特异表达（p）RR的转基因大鼠，发现6月龄的大鼠出现血压升高、心率加快的现象，并且症状随年龄的增加更加严重。在糖尿病大鼠的心脏中，（p）RR在蛋白和mRNA水平均增加三倍［9］。这些结果说明（p）RR可能参与高血压与糖尿病等病理过程。由于该基因在心肌中有广泛表达，我们推测它在心脏的生理功能中发挥一定的作用。因此，本文构建了心脏特异表达（p）RR的转基因小鼠，并初步探讨了该基因对心脏功能的影响。

1 材料和方法

1.1 （p）RR基因的克隆和转基因小鼠的制备

从OriGene公司购买的带有（p）RR cDNA的质粒（Sc111138），通过PCR扩增获得带有SalI和AflII酶切位点的（p）RR基因cDNA目的片断，引物序列如下Ps（SalI）：5＇-CCGGTCGACCACCATGGC TGTGTTTG-3＇；Pa（A flII）：5＇-CTCTACTTAAGCAT CACAGGCACACACAA-3＇（由invitrogen公司合成）。反应条件：94℃预变性5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃2m in，共30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后克隆到pMD18-T Vector，经测序比对后，正确无突变碱基序列连入α-MHC（Genbank accession no.U_71441，clone 26）启动子下游，构建心脏特异表达（p）RR的转基因载体，经NotⅠ将表达载体线性化，Sephedex G50柱纯化，将DNA浓度调整至5 ng/μL，用显微注射法注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中（C57BL/6J康蓝公司SCXK（京）2004001），用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠（TE2000-U显微注射仪）。实验中涉及动物的操作程序已经得到医科院实验动物研究所动物福利和管理委员会的批准，批准号：ILASGC-2010-033。

1.2 PCR法鉴定（p）RR转基因小鼠的基因型

转基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA［10］，用PCR法对转基因小鼠进行基因型检测。αMHC-（p） RR转基因小鼠PCR引物序列如下Ps：5＇ CTTTCAGTCACATTGCGGCA-3＇，Pa：5＇-TGCGTTCCC ACCATAGAGAC-3＇（由invitrogen公司合成），反应条件为：94℃预变性5 m in，变性94℃30 s，退火59℃30 s，延伸72℃30 s，共30个循环。

1.3 Westernblot

用小鼠脱颈椎法，牺牲小鼠，取100 mg心脏组织加入1 m L预冷的蛋白裂解液，冰上充分研磨，之后冰上静置30 min，再将组织匀浆于4℃，12000 r/ m in离心30 m in，吸取上清即为心脏组织总蛋白。取30μg蛋白上样，15％的SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移到0.45μm硝酸纤维素NC膜上（Millipore，美国）。5％脱脂奶粉封闭液，室温下置摇床上封闭1 h，再用TBST稀释的羊抗人源重组的（p）RR多克隆抗体（AF5176，R＆D，美国）（1∶250稀释），4℃摇床杂交过夜。次日，待恢复室温后，TBST洗3次，每次10 min。置入TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体（Pierce，美国）（1∶15000），室温杂交1 h，采用HRP-GAPDH作为内参，TBST洗3次，每次10 min。将膜置于化学发光液中，X-Ray胶片曝光、显影及定影。

1.4 免疫组织化学

选用3月龄的转基因阳性和同窝阴性小鼠心脏固定在中性福尔马林中24 h，进行脱水、包埋、切片，常规脱蜡入水，枸橼酸钠抗原热修复，待恢复室温后3％H2O2去内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，滴加（p）RR抗体（AF5176，R＆D，美国）（1∶50稀释），湿盒内4℃过夜；PBS洗3×5 min后加入兔抗山羊二抗（具体用法详见二步法免疫组化试剂盒，PV-2003），PBS洗3×5 m in，DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，脱水、透明、封片，光镜下常规观察病理切片。

热修复和去除过氧化物酶的病理切片，分别滴加识别高尔基体标志蛋白抗体：GM30（ab1299，Abcam，美国）（1∶100）/识别肌浆网标志蛋白抗体：PDI（ab2792，Abcam，美国）（1∶100）和（p）RR抗体（ab64957，Abcam，美国）（1∶25稀释）湿盒内4℃过夜，PBS洗3×5 min后加入DyLight-标记的抗小鼠IgG（1∶100，KPL）and A lexa 488-标记的羊抗兔IgG （1∶100，Invitrogen）37℃孵30 min，ProLong Gold抗淬灭剂封片（Invitrogen）。制备好的病理切片利用共聚焦显微镜观察分析（Leica TCS SP2，Germany）.

1.6 心脏超声检查

选用3月龄的转基因阳性和同窝阴性小鼠，用三溴乙醇（0.2 m L/10g体重）麻醉，脱去心前区的被毛，选用30 Hz的探头，按Zhou［11］报道的方法进行心脏超声影像分析（Vevo770小动物超声探测系统，加拿大）。记录左室收缩末期内径（left ventricular internal diameter at end-systole，LVID；s）等参数，左室收缩末期容积（left ventricular end-systolic volume，LVESV），射血分数（percent ejection fraction，EF％），短轴缩短率（percent fractional shortening，FS％）由计算得出。

1.7 统计学分析

数据SPSS统计软件处理。先进行数据的方差齐性检验，组间比较采用独立性t检验。计量数据用均数±标准差（±s）表示。

2 结果

2.1 （p）RR转基因小鼠的建立

用PCR法从购买的质粒中扩增出人源（p）RR基因，测序结果显示同已报道的（p）RR序列完全一致（GenBank No.NM_005765.2），将其连到α-MHC心脏特异表达的启动子下游，构建α-MHC-（p）RR转基因表达载体（彩插3图1A）。小鼠出生14 d提取基因组DNA，用PCR扩增（p）RR基因339 bp目的片段，鉴定（p）RR转基因小鼠的基因型（彩插3图1B），共得到4只首建鼠，且均可传代。分别提取（p）RR首建鼠的F1代阳性转基因小鼠和同龄阴性对照小鼠心脏组织总蛋白，用（p）RR抗体进行Western blot分析，筛选出一个高表达明显的品系，Western blot图谱显示有三条目的带，分子量大小分别约为：35×103，30×103和28×103。35×103的蛋白带是全长的（p）RR，30×103和28×103两条蛋白带为其截短形式［s（p）RR］，从图中我们可以看出，转基因小鼠心脏组织内全长的（p）RR蛋白表达量没有明显增加，而两种截短的蛋白表达量却明显的高于同窝阴性小鼠（彩插3图1C）。取1月龄转基因小鼠和同窝阴性对照小鼠用（p）RR抗体进行心脏免疫组化分析，结果显示转基因小鼠的心脏中（p）RR的表达明显高于同窝阴性对照小鼠（彩插3图1D）。

2.2 免疫荧光共聚焦方法进行（p）RR亚细胞结构的定位

取3月龄转基因小鼠和同窝阴性对照小鼠，取出心脏制备成石蜡切片，分别用识别高尔基体或内质网的标志分子的抗体与（p）RR抗体进行双色荧光免疫组化分析，结果显示转基因小鼠和对照小鼠的（p）RR蛋白与两种细胞器的标志分子能达到共定位，说明转基因表达的（p）RR蛋白与內源（p）RR蛋白均存在于高尔基体和内质网上，并且可以看出转基因小鼠心脏中（p）RR蛋白的表达要明显高于同窝阴性对照小鼠心脏中的表达（彩插4图2A，B）。

2.3 超声检查（p）RR转基因小鼠的心脏几何构型及心功能

将3月龄的 （p）RR转基因小鼠和同窝阴性对照小鼠进行心脏超声影像分析（表1），结果显示，与同窝阴性对照小鼠相比，（p）RR转基因小鼠收缩期左室内径（LVID，systolic）降低9％（P＜0.05，n= 18），收缩期容积（LVESV，systolic）减少了23％（P＜0.05，n=18），射血分数EF（ejection fraction）升高14％（P＜0.01，n=18），短轴缩短率FS（fraction shortening）升高20％（P＜0.01，n=18）。结果说明，（p）RR基因的转入增强了心脏的收缩性能，使心功能有了明显的提高。

2.4 转基因表达（p）RR基因使转基因小鼠心脏中钙泵、钠-钙交换体1表达下调，肌钙蛋白T表达上调

提取3月龄的（p）RR转基因小鼠和同窝阴性对照小鼠心脏组织总蛋白，进行钙泵（ATP2A2）、钠-钙交换体1（NCX 1）以及肌钙蛋白T（cTnT）抗体的Western blot检测分析，结果发现ATP2A2和NCX 1表达均下调，其中钙泵表达量的降低十分显著；而肌钙蛋白T表达量上调（图3）。

3 讨论

自2002年Nguyen等［1］首次报道了人肾素（原）受体的存在之后，人们关于此受体的生物功能研究都集中在全长的（p）RR形式。Cousin等［12］通过对小鼠胚胎干细胞（E14），大鼠平滑肌细胞（VSMC）和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等多种细胞的培养基进行Western blot分析，发现一个28×103（p）RR低分子量形式的存在，由于这种形式的蛋白是在培养基中发现的，所以被命名为s（p）RR。进一步研究发现，s（p）RR是由弗林蛋白酶剪切产生的，而且s（p）RR存在于血浆和尿液中。不久，Yoshikawa等［13］发现了一种由ADAM19剪切产生的游离在培养基中一种s（p）RR形式，这两种s（p）RR形式是否是（p）RR的同一种剪切形式以及它们各自的功能，现在还有待进一步研究。本文构建的（p）RR转基因小鼠，除了全长的（p）RR外，两条截短的蛋白从分子量大小上看，应该就是以上两篇文献中的所发现的s（p）RR，本文构建的转基因小鼠全长（p）RR蛋白没有明显增多而两种s（p）RR蛋白明显高于同窝阴性对照小鼠，这一点还有待进一步解释。这两个独立的研究小组［12，13］在体外培养的细胞中也都进行了（p）RR的亚细胞定位，结果表明（p）RR主要存在于内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器中。本研究在小鼠心脏组织中进行了（p） RR蛋白的定位研究，证实了过表达的（p）RR蛋白与内源性的（p）RR蛋白在小鼠心脏组织中均定位在内质网和高尔基体上，并且转基因小鼠心脏中（p）RR蛋白的表达明显高于对照小鼠心脏组织。心肌细胞中内质网结构非常发达，对钙的储存、释放和心脏的收缩、舒张起到重要的作用，（p）RR定位在内质网上可能更有利于其参与到心肌节律性收缩舒张活动过程中。高尔基体是将蛋白进行加工、分类和包装的主要场所，推测（p）RR的两种s （p）RR形式在高尔基体上被剪切产生，并且驻留于此。

表1 三月龄（p）RR转基因小鼠心脏结构和功能M超生分析（n=18） Tab.1 The cardiac structure and function analysis of 3-month transgenic mice by M-mode echocardiograph（n=18）

图3 转基因表达（p）RR引起ATP2A2、NCX 1和cTnT蛋白表达变化Fig.3 Transgenic（p）RR leading to alter the expression level of ATP2A2/NCX 1/cTnT

钙离子作为兴奋-收缩的偶联介质，在维持心肌正常收缩和舒张过程中起到重要的作用。心肌细胞的收缩和舒张与细胞内钙的释放与储存相偶联。钙循环主要包括内质网中储存的钙的释放、钙的回摄和钙的储存三个过程。位于细胞膜表面的L型钙通道受到刺激后会激活内质网膜上的RyR受体（ryanodine receptor）从而引起内网中钙的释放，此时游离的钙离子会结合肌钙蛋白引起肌丝的滑动，使心肌产生收缩运动，随着舒张过程的开始内质网膜上的ATP2A2逐步将细胞内游离的钙回收至内质网中，同时NCX 1也将少部分的钙转运至细胞膜外。可以看出在这一过程中ATP2A2和NCX 1主要起到将细胞中游离的钙转运回内质网中，并且在这一过程中ATP2A2起到关键的作用。本文中发现（p）RR转基因小鼠心脏中ATP2A2和NCX 1表达量明显降低，这显然影响了游离钙离子向内质网中的回摄，细胞内钙离子浓度持续的维持在高浓度的状态下，类似于钙超载的状态，使肌钙蛋白等钙相关蛋白不得不继续工作，造成心肌收缩力增强。同时我们检测的肌钙蛋白T在（p）RR转基因小鼠心脏中的表达确实也是升高的。心脏超声结果同时显示，（p） RR转基因小鼠心脏心功能明显增强，这也是心肌收缩力增强的结果。

在心脏中过表达（p）RR能够引起心脏收缩功能明显增强，同时我们发现ATP2A2、NCX 1和cTnT蛋白表达量出现了明显变化，转基因小鼠心功能增强。过表达的（p）RR是如何调节这些钙离子相关蛋白的从而影响到了心脏功能，这些都有待于我们进一步研究。不过本研究提示我们，（p）RR可能是通过调节心脏中的钙离子从而影响心肌功能的。在接下来的的研究中，我们将从分子机制出发，探求该转基因小鼠的表型的内在机制，更加深入的研究（p）RR在心脏中的生物学活性。

（p）RR的发现，为经典的肾素-血管紧张素系统增添了新的内容，使这一系统重新成为研究热点。目前人们已经发现（p）RR在心血管方面的重要性，关于（p）RR在心脏中发挥的生物活性还有待进一步研究，它可能成为治疗心血管疾病的重要靶点并且对其信号通路的研究有利于我们对一些心血管疾病发生发展的分子机制的深入了解。

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