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基于反义RNA技术的FabI抑制剂筛选模型的构建

2012-02-03殷瑜戈梅钱秀萍陈代杰

中国医药生物技术 2012年3期
关键词:反义质粒抑制剂

殷瑜,戈梅,钱秀萍,陈代杰

基于反义RNA技术的FabI抑制剂筛选模型的构建

殷瑜,戈梅,钱秀萍,陈代杰

目的基于反义 RNA 沉默技术构建针对细菌 FabI 的超敏全细胞筛选模型,用于筛选 FabI 抑制剂。

方法以Escherichia coli基因组 DNA 为模板,PCR 扩增fabI基因的 -74 ~ 86 bp 核苷酸序列,反向插入携带 paired termini 结构的反义质粒 pHN678 中,得到重组质粒pHNF,再转化至E.coli中,得到反义工程菌E.coli/pHNF;通过平板表型观察对反义工程菌进行筛选;考察了 IPTG浓度对筛选模型的影响,确定 96 孔板抗菌筛选模型的条件,并用三氯生作为阳性对照、氨苄西林和浅蓝菌素作为阴性对照对该模型进行评价。

结果获得了针对fabI的反义工程菌,确定了最适 IPTG浓度为 40 μmol/L,成功构建了 FabI 特异性酶抑制剂的超敏全细胞筛选模型,并验证了其可行性。应用该筛选模型对5847 个内生真菌次级代谢产物进行活性筛选,初筛阳性率约为 9.7%,经复筛后获得 8 份阳性样品。

结论成功建立了基于反义 RNA 沉默技术的 FabI 超敏全细胞筛选模型,并利用该模型筛选到 8 份阳性样品。

RNA,反义; 药物评价,临床前; 烯脂酰-ACP 还原酶

反义 RNA 技术可以在转录或翻译水平沉默靶基因,选择性控制靶基因的蛋白表达量,从而使所构建反义菌株对外界特异性抑制剂非常敏感。该技术已经成功用于抗菌药物筛选模型的构建,并筛选获得了能够有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)的平板霉素[6-7]。本文应用反义 RNA 技术构建针对 FabI的反义Escherichi coli工程菌,以此构建靶向 FabI的全细胞筛选模型,并将该模型用于筛选植物内生菌代谢产物的活性组分。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及连接酶E.coliDH5α、E.coliBL21、E.coliTOP10 菌株由本实验室保藏;质粒pHN678(携带 paired termini 结构)由英国皇家兽医学院 Liam Good 实验室赠送;PCR 产物纯化和凝胶回收试剂盒购于杭州爱思进生物技术公司;T4 DNA 连接酶、PrimeStar HS DNA 聚合酶和各类内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.2 仪器 680 型酶标仪为美国 Bio-Rad 公司产品;棱光 UV762 紫外/可见分光光度计为上海精密科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的构建及验证

1.2.1.1 反义工程菌的构建 根据E.coliBL21(DE3)基因组(Gene-Bank号:NC012947)设计用于扩增as-fabI片段的引物,由上海生工生物工程公司合成。PCR 产物经电泳鉴定、纯化后重组至pHN678 中获得重组质粒 pHNF,转化进入E.coli/TOP10 感受态细胞中,再通过质粒酶切验证。

重组质粒和空白质粒 pHN678 分别转化E.coli,获得相应反义工程菌株E.coli/pHNF 及对照菌E.coli/pHN678。反义引物:as-fabI正向:CCG GAGCTC(XhoI)TTCGTACTGTTTACTAAAAC;as-fabI反向:TAATCCATGG(NcoI)TGCATCGCC TGAGCGATACC。PCR 扩增条件为:94 ℃ 预变性2 min;94 ℃、2 min,共 30 次循环变性;51.5 ℃30 s;72 ℃ 30 s;72 ℃ 延伸 4 min。

1.2.1.2 反义工程菌的筛选 采用平板表型观察法,阳性菌在含诱导剂 IPTG 的平板上生长受抑制。将单菌落挑至液体 LB 培养基中,37 ℃ 过夜培养后,对其进行适当稀释后,以携带空白质粒pHN678 的菌株作为对照,取 10 μl 点种于含有一定浓度 IPTG 及 30 μg/ml 氯霉素的平板上过夜培养。以经低浓度 IPTG 诱导、生长最易受抑制的菌落为最适工程菌。

1.2.2 FabI 抑制剂液体筛选模型的建立 在两块无菌 96 孔板各孔中分别加入OD630值为 0.1 的初始菌浓、氯霉素浓度为 30 μg/ml、IPTG 浓度分别为 0、5、10、20、30、40、50、60 μmol/L 的 LB液体菌(反义工程菌株E.coli/pHNF 及对照菌E.coli/pHN678)悬液 150 μl,于 37 ℃、100 r/min 条件下振荡过夜培养,用酶标仪测定OD630,分析数据,选取影响反义菌株生长的 IPTG 临界浓度为筛选模型浓度。

1.2.3 模型评价 以 0.5、2.5、5.0 μg/ml 的氨苄西林和 15、22.5、30 μg/ml 的浅蓝菌素为阴性对照,以 25、37.5、50 μg/ml 三氯生为阳性对照评价该筛选模型的有效性,每隔 1 h 测定OD630值。每个浓度重复 3 次。

1.2.4 样品活性筛选流程 在 1.2.2 模型建立的基础上将 100 μg/ml 的待测样品加入不同浓度IPTG 菌悬液的 96 孔板培养孔中,37 ℃、100 r/min条件下振荡过夜培养,用酶标仪测定OD630,以如下公式计算抑制率。

2 结果

2.1 反义工程菌的构建及筛选

2.1.1 反义质粒的构建及验证 如图 1所示,通过 PCR 方法扩增得到的产物大小为 179 bp,与所选择的基因长度(包含引物中的酶切位点和保护碱基)相符。

图 1 fabI 基因 -75 ~ 86 bp 序列的 PCR 扩增结果Figure 1 PCR product of fabI -75 ~ 86 bp

PCR 产物与 pHN678 连接获得重组质粒pHNF,转化E.coliDH5α 后经酶切验证,结果如图 2,说明fabI基因的 -75 ~ 86 bp 序列以正确的方向插入到 pHN678 中。

图 2 重组质粒 pHNF 的双酶切鉴定Figure 2 Enzymatic identification of pHNF

图 3 E.coli DH5α/pHNF、E.coli TOP10/pHNF 和 E.coli BL21/pHNF 的表型观察结果(678:E.coli/pHN678;F:E.coli/pHNF;D:E.coli DH5α;B:E.coli BL21;T:E.coli TOP10)Figure 3 Phenotype of E.coli DH5α/pHNF, E.coli TOP10/pHNF and E.coli BL21/pHNF (678 and F indicate E.coli/pHN678 and E.coli/pHNF, respectively.D: E.coli DH5α; B: E.coli BL21; T: E.coli TOP10)

表 1 IPTG 浓度对 E.coli TOP10/pHN678 和 E.coli TOP10/pHNF 生长的影响Table 1 Effect of IPTG on the growth of E.coli TOP10/pHN678 and E.coli TOP10/pHNF

图 4 氨苄西林对 E.coli TOP10/pHN678(A)和 E.coli TOP10/pHNF(B)生长曲线的影响Figure 4 Effect of ampicilin on the growth curve of E.coli TOP10/pHN678 (A) and E.coli TOP10/pHNF (B)

2.1.2 宿主的选择 选择E.coliDH5α、E.coliTOP10、E.coliBL21 作为宿主,考察各反义工程菌的敏感性。结果(图 3)表明在接种量、IPTG 浓度一定时,E.coliTOP10/pHNF 更容易受抑制。因此,选择E.coliTOP10/pHNF 用于后续抗菌筛选模型的构建。

2.2 FabI 抑制剂液体筛选模型条件的确立

由表 1 看出,40 μmol/L 为 IPTG 的临界浓度。当 IPTG 浓度低于该浓度时,工程菌E.coliTOP10/pHNF 与对照菌E.coliTOP10/pHN678 两者OD值相近。高于 40 μmol/L 时,工程菌的OD值低于对照菌,且随着 IPTG 浓度升高差距越明显。

因此,确立筛选模型条件为:96 孔酶标板各孔加入含有 30 μg/ml 氯霉素、40 μmol/L IPTG 的LB 液体培养基 150 μl,初始菌浓OD630为 0.1。加入一定浓度的待测样品后,37 ℃,100 r/min 振荡培养过夜。比较同一样品对应的对照孔(含对照菌)和测试孔(含反义工程菌)的OD630值,测试孔的OD值低于对照孔的为阳性结果孔。

2.3 FabI 抑制剂筛选模型的验证

选用氨苄西林(常规细菌抑菌剂)和浅蓝菌素(细菌 FabF/FabH 抑菌剂)作为阴性对照,三氯生作为阳性对照,验证上述模型条件的可行性。

图 5 浅蓝菌素对 E.coli TOP10/pHN678(A)和 E.coli TOP10/pHNF(B)生长曲线的影响Figure 5 Effect of cerulenin on the growth curve of E.coli TOP10/pHN678 (A) and E.coli TOP10/pHNF (B)

图 6 三氯生对 E.coli TOP10/pHN678(A)和 E.coli TOP10/pHNF(B)生长曲线的影响Figure 6 Effect of tricloson on the growth curve of E.coli TOP10/pHN678 (A) and E.coli TOP10/pHNF (B)

由阴性对照实验结果可知,工程菌和对照菌随氨苄西林和浅蓝菌素浓度变化呈现相同的抑制趋势(图 4 和图5),而阳性对照组的实验结果显示,当三氯生浓度低于 25 μg/ml 时,两株菌株均未被抑制;而增至 37.5 μg/ml 及 50 μg/ml 时,两株菌均出现抑制现象,且工程菌的被抑制程度明显高于对照菌(图 6)。说明该筛选模型的特异性及灵敏度较高,达到理想要求。

2.4 样品的活性筛选结果

2.4.1 样品初筛 将实验室化合物库保藏的5847 份植物内生真菌发酵冻干样品应用于 FabI抗菌药物筛选模型上进行筛选,获得了 559 份阳性样品,阳性率为 9.7%。

2.4.2 样品复筛 从 559 份初筛阳性样品的对应产生菌株中挑选了 60 株重新发酵制备样品,应用模型筛选方法进行复筛,得到 8 份阳性样品,阳性率为 13.3%。

3 讨论

自然界中微生物的多样性及其代谢产物的多样性,提供了发现新药以及先导化合物的不竭动力。但随着从微生物次级代谢产物中获得的抗生素的大量问世,应用常规抗生素筛选模型,从自然界筛选和发现新药变得越来越困难[8],而应用反义技术发现的新型抗生素—平板霉素为解决抗菌药物筛选问题带来了曙光[6-7]。本研究中我们应用反义RNA 技术建立了以 FabI 为靶点的超敏全细胞药物筛选模型,初筛获得了 559 份阳性样品,但对其中的 60 份样品复筛后仅获得了 8 份阳性样品,这可能是复筛所用样品为再发酵样品,再发酵过程中植物内生菌的易退化性导致了发酵样品的活性丢失。期望能够通过化合物分离纯化的方法,获得针对 FabI 的靶标明确、细胞渗透性强、毒性小的活性化合物。

[1]Chen DJ, Ge M, Luo MY.History and trend of anti-bacterial antibiotics R & D.Chin J Antibiot, 2009, 34(z1):45-50.(in Chinese)

陈代杰, 戈梅, 罗敏玉.抗细菌感染药物的研究历程与趋势.中国抗生素杂志, 2009, 34(增刊):45-50.

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[8]Ge M, Chen DJ.Focus on the development of new drug derived from microbiology.Chin Bull Life Sci, 2005, 17(1):15-18.(in Chinese)

戈梅, 陈代杰.关注微生物来源的新药开发.生命科学, 2005,17(1):15-18.

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):197-201

Establishment of screening model for FabI inhibitors based on antisense RNA technology

YIN Yu, GE Mei, QIAN Xiu-ping, CHEN Dai-jie

ObjectiveTo establish a highly sensitive whole-cell screening model targeting FabI based on antisense RNA silencing technology for FabI inhibitors screening.

MethodsIn order to improve silencing effect, vector with paired termini was utilized.Transformants were identified by phenotype screening on solid plates.Effect of IPTG concentration was studied and the optimal screening parameters were determined.Triclosan and ampicillin were used as positive and negative control to evaluate the feasibility of this screening model, respectively.

ResultsFabI antisense strain was obtained.The optimal concentration of IPTG was 40 μmol/L.The highly sensitive whole-cell FabI specific inhibitor screening model was established and evaluated.5847 fermentation samples from endophytic fungi were screened and the positive rate was about 9.7%.Eight active samples were gained in secondary screening.

Conclusion One highly sensitive whole-cell FabI specific inhibitor screening model was established based on antisense RNA technology and eight active samples were gained.

RNA, antisense; Drug evaluation, preclinical; FabI

CHEN Dai-jie, Email: hccb001@163.com

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2012, 7(3):197-201

随着抗生素的滥用,临床致病菌的耐药性问题也日趋严重[1]。研究新的抗菌靶点、并基于此建立新的筛选模型成为发现抗耐药菌新药的重要途径。脂肪酸是细胞生物膜等的重要组成成分,而细菌和人类的脂肪酸合成分属于两种途径,前者进行的是II 型脂肪酸合成途径,而后者则属于 I 型,这一差别使得细菌脂肪酸合成酶系成了当今新型抗菌药物筛选的靶位之一[2-4]。烯脂酰-ACP 还原酶(FabI)是大部分细菌脂肪酸合成所必需的酶,是一种由fabI基因编码的 NADH 或 NADPH 依赖型单功能酶,而真核细胞中没有此酶,它已逐渐成为抗菌药物研究的热点靶位。传统的 FabI 抑制剂是二氯苯氧氯酚(三氯生),已被广泛应用于肥皂、牙膏等日用化学品之中[5]。但到目前为止,还

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.007

“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09302-004);国家自然科学基金(81102355)

200240 上海交通大学药学院(殷瑜、钱秀萍、陈代杰);200240 上海来益生物药物研发中心(殷瑜、戈梅);200040 上海医药工业研究院(陈代杰)

陈代杰,Email:hccb001@163.com

2012-03-29没有细菌脂肪酸生物合成酶 FabI 抑制剂在临床上得到应用。因此,寻找化学结构新颖、特异性强、低毒高效的抗菌新药 FabI 抑制剂,仍然是药物研究工作者重要的研究领域。

Author Affiliations: School of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University, 200240 Shanghai, China (YIN Yu, QIAN Xiu-ping, CHEN Dai-jie); Shanghai Laiyi Biological Drug Research and Development Center Co.Ltd., 200240 Shanghai, China (YIN Yu, GE Mei);Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, 200040 Shanghai, China (CHEN Dai-jie)


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