都伟欣，杨蕾，苏城，沈小兵，徐苗，卢锦标，王国治，陈保文

结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白的制备和应用

都伟欣，杨蕾，苏城，沈小兵，徐苗，卢锦标，王国治，陈保文

全球结核杆菌感染者高达 20 亿人，每年新发病例约800 万 ～ 1000 万，其中我国每年新发患者高达 150 万。结核杆菌流行病学的一个重要特征是结核分枝杆菌的潜伏感染。结核分枝杆菌潜伏感染是一种亚临床状态，其中约有 10% 的结核分枝杆菌潜伏感染者会发展成为结核病患者[1]。流行病学调查显示，我国受结核杆菌感染人数超过5 亿。因此，如何有效、全面地筛查出结核病患者和结核杆菌潜伏感染人群，是结核病控制首要解决的问题。结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白主要为小分子的分泌性蛋白，这些蛋白抗原是记忆性免疫 CD4+T 细胞的靶分子[2]。以早期培养滤液蛋白为刺激源，结合 γ 干扰素释放技术，可以用于结核杆菌感染的体外诊断。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

H37Rv 分枝杆菌菌种（CMCC93009）由本室保存提供；超滤离心管（5000 Da）和 0.22 μm 滤器（500 ml）均购于美国 Millipore 公司；结核菌素纯蛋白衍化物（PPD）（批号：20080901）由北京祥瑞生物制品有限公司提供；结核感染 T 细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB，批号 073），淋巴细胞分离液（批号 20090228）、RPMI1640 无血清培养基（批号8109040）和 AIM V 细胞培养液（批号 564772）均购自上海信长医疗器械有限公司；台盼蓝染液（批号 55k2342）购自美国 Sigma 公司；其余均为实验室常用试剂。

全温振荡培养箱为东联电子技术有限公司产品；冷冻离心机购自德国 Eppendorf 公司；分光光度计购自日本Shimadzu 公司；倒置显微镜购自日本Olympus 公司；CO2孵箱购自美国 Thermo 公司；ELISPOT 读板仪购自美国CTL 公司。1.2 方法

1.2.1 早期培养滤液蛋白的制备 首先将 H37Rv 分枝杆菌接种于罗氏鸡蛋斜面培养基上，37 ℃ 培养 21 d。取斜面生长良好且无污染的菌体，用生理盐水洗涤菌种，收集至离心桶内，4 ℃，8000 r/min，离心 30 min，离心结束后弃去培养上清，收集菌体。用液体苏通培养基洗涤菌体 3 次，洗涤方法为补充液体苏通培养基到离心前的体积，再离心收集菌体。取液体苏通培养基重悬洗涤后的菌体，将 2.5 ml 的1 × 107个/ml 的接种菌液接种于 500 ml 的装有 200 ml液体苏通培养基的三角瓶中，100 ～ 200 r/min，37 ℃ 振荡培养。培养至第 7 天，将结核分枝杆菌菌液收集到离心桶内，4 ℃，8000 r/min，离心 30 min，离心结束后弃去菌体，收集培养上清。将培养上清过 0.22 μm 滤膜除菌。将除菌过滤后的培养上清置于超滤离心管中进行超滤离心，4 ℃，4000 r/min，控制离心时间使培养上清浓缩 10 倍；然后补加磷酸盐缓冲液至初始体积，相同条件再次进行超滤离心浓缩，步骤重复 3 次，将培养上清中的培养基成分去除，置换成磷酸盐缓冲液；最后浓缩得到的蛋白即为早期培养滤液蛋白，以 Lowery 法测蛋白浓度进行定量。

1.2.2 早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法用于结核病的辅助诊断 实验对象为临床确诊的结核病患者（简称患者）和无结核接触史且接种过卡介苗（BCG）的健康志愿者（简称健康接种者），其中患者 24 例，来源于北京市结核病控制研究所；健康接种者 20 例，来源于北京市结核病控制研究所和本室工作人员。分别取肝素钠抗凝静脉血 5 ～10 ml，应用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，单个核细胞经过计数并调整细胞浓度为 2.5 × 106个/ml。在已经包被 INF-γ 单抗的 96 孔板上，分别加入 50 μl 培养基为阴性对照，50 μl 植物血凝素（PHA）为阳性对照，50 μl 不同浓度（分别为 0.2、1 和 5 μg/ml）的早期培养滤液蛋白为测试孔。然后在每孔中加入 100 μl 细胞悬液。在 5%CO2，37 ℃ 条件下共同孵育 16 ～ 20 h。孵育结束后弃去培养液，用 200 μl PBS 缓冲液重复洗板 4 次。每孔加入 50 μl标记抗体工作液，置 2 ～ 8 ℃ 孵育 60 min。孵育结束后弃去反应孔内液体，用 200 μl PBS 缓冲液重复洗板 4 次。每孔加入显色底物溶液 50 μl，在室温中反应 5 ～ 10 min 后形成斑点。用实验用水洗涤各孔终止反应。以 ELISPOT 读板仪计数各孔斑点个数以进行诊断，其中阳性判断标准为：实验孔斑点数 － 阴性孔斑点数 ≥ 6 个；阴性判断标准为：实验孔斑点数 － 阴性孔斑点数 ＜ 6 个。

1.2.3 早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法用于筛查结核杆菌潜伏感染人群 实验对象为 PPD 皮试强阳性者[即皮试后 72 h 局部硬结直径 ≥ 15 mm 和（或）伴有水疱、坏死者]，男女均有，共 32 例。分别以早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法和市售 T-SPOT.TB 试剂盒进行体外诊断。早期培养滤液蛋白工作浓度为 5 μg/ml，具体操作步骤同 1.2.2。T-SPOT.TB 试剂盒操作步骤为：96 孔板中分别加入 50 μl 培养基为阴性对照，50 μl 植物血凝素（PHA）为阳性对照，分别以 50 μl 结核分枝杆菌特异性ESAT6 和 CFP10 肽段库作为刺激源，然后在每孔中加入100 μl 细胞悬液。在 5% CO2，37 ℃ 条件下共同孵育 16 ～20 h。孵育结束后 PBS 洗板 4 次，加入 50 μl 碱性磷酸酶标记的二抗，2 ～ 8 ℃ 孵育 1 h。PBS 洗板 4 次。每孔加入显色底物液 BCIP / NBTPLUS，室温中静置 7 min，去离子水终止反应。斑点计数和判断标准同早期培养滤液蛋白IFN-γ-ELISPOT 方法。

2 结果

2.1 早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法用于结核病辅助诊断的灵敏度和特异性分析

实验对象为健康志愿者 20 例，结核患者 24 例。以不同浓度早期培养滤液蛋白为刺激源对以上志愿者和患者进行体外 IFN-γ-ELISPOT 诊断，实验数据见图 1。以健康志愿者结果分析不同浓度早期培养滤液蛋白的诊断特异性，以患者结果分析不同浓度早期培养滤液蛋白的诊断敏感性（表 1）。

根据不同浓度的早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT诊断结果，选取敏感性和特异性均较高的诊断组，确定早期培养滤液蛋白的最适工作浓度为 5 μg/ml，建立标准化的早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 诊断方法。

2.2 早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法用于筛查结核杆菌潜伏感染人群的研究

结核杆菌潜伏感染人群尚无诊断金标准，通常将 PPD皮试结果呈强阳性者认为是结核杆菌潜伏感染人群。实验选取 PPD 皮试强阳性者共 32 例，以 5 μg/ml早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法和 T-SPOT.TB 试剂盒分别对此部分人群进行体外诊断，分析早期培养滤液蛋白IFN-γ-ELISPOT 方法与 PPD 皮试方法的一致性，并同时与T-SPOT.TB 结果进行比较。实验结果见表 2。

图 1 不同浓度早期培养滤液蛋白在健康志愿者（A）和结核病患者（B）中的试验孔斑点数结果

3 讨论

我国结核病疫情严重，而潜伏性感染人群大、范围广又是导致结核病暴发的一个重要因素。如果能全面有效地诊断出结核杆菌潜伏感染人群并能在感染的早期进行治疗和干预，就可以有效预防结核病的发生。但结核杆菌潜伏感染人群的诊断尚无金标准[3]，目前 PPD 皮试试验是诊断结核杆菌潜伏感染人群的常用方法，但这一方法有一定的缺陷性。由于试验所用 PPD 抗原为结核分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗（BCG）所共有，具有交叉反应，故诊断特异性较差[4-5]。因此，寻找合适的结核杆菌特异性抗原及新的诊断技术，对像中国这样普遍接种卡介苗的国家将十分必要，也尤为重要。

IFN-γ-ELISPOT 方法是近年来发展起来的用于结核杆菌感染的体外诊断方法。此方法结合特异性结核抗原即能发展成结核病辅助诊断和潜伏感染人群筛查的具有较好敏感性和特异性的诊断方法。

单一的抗原缺乏良好的诊断敏感性，具有结核杆菌特异性的复合抗原将是理想的抗原选择。文献报道显示：结核杆菌早期培养滤液蛋白可能存在 ESAT6、MPT64 和 Ag85b等蛋白，这些分泌性蛋白抗原均是记忆性免疫 CD4+T 细胞的靶分子，能够体外诱导 T 淋巴细胞分泌 INF-γ，是理想的 IFN-γ-ELISPOT 诊断方法的体外刺激源。实验制备早期培养滤液蛋白，以其作为刺激源，结合 IFN-γ-ELISPOT 方法，建立早期培养滤液蛋白-IFN-γ-ELISPOT 诊断技术。实验结果显示优化后的该方法在结核病人中的诊断敏感性为100%，在健康志愿者中的诊断特异性为 90%，具有很好的诊断效能。

目前国际上诊断结核杆菌潜伏感染人群较为常用的是TB-SPOT.TB 试剂盒[6]，该试剂盒是应用 ELISPOT 技术定量检测分泌 γ 干扰素的效应性 T 细胞来诊断结核杆菌感染。该试剂盒选用了只存在于结核分枝杆菌基因组，但在卡介苗和非致病性分枝杆菌中普遍缺失的 RD1 区编码蛋白作为特异性的 T 细胞抗原。抗原均采用的是传统的合成肽加载刺激的方法，即使用来源于特异性抗原的相互重叠的合成肽混合物作为检测样本的刺激源，所用的特异性抗原主要是结核分枝杆菌早期分泌蛋白中的 ESAT-6 和 CFP-10。但此方法也有其局限性，即混合多肽池并不能包括结核分枝杆菌全部的表位肽，在检测中仍存在缺失现象，会造成检测遗漏，产生假阴性，特别对于我国这样一个疫情严重、潜伏性感染范围大的情况，能够尽可能全面地检出潜伏性感染者有其重要的现实意义，而 TB-SPOT.TB 试剂盒在这一方面存在局限。

实验比较早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 和T-SPOT.TB 试剂盒两种方法与 PPD 皮试结果的一致性。在32 例 PPD 皮试强阳性人群中分别应用这两种方法进行体外诊断，结果显示：早期滤液蛋白-INF-γ-ELISPOT 方法与PPD皮试强阳性结果具有很高的一致性（93.7%），而现有的 T-SPOT.TB 试剂盒一致性仅为 50%。

早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法与 PPD 皮试强阳性结果一致性高，表明其能够比市售 T-SPOT.TB 试剂盒更广泛地检测出结核杆菌潜伏感染人群。其同时与 PPD比较，可能还具有较高的检测特异性将能够保证部分卡介苗接种人群造成的强阳性反应者被剔除。在我国这样高感染、高发病且普遍接种卡介苗的国家，早期培养滤液蛋白IFN-γ-ELISPOT 方法在结核杆菌潜伏感染人群中的筛查较其他方法具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

[1]Andersen P, Doherty TM, Pai M, et al.The prognosis of latent tuberculosis: can disease be predicted? Trends Mol Med, 2007,13(5):175-182.

[2]Demissie A, Ravn P, Olobo J, et al.T-Cell recognition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate Fractions in tuberculosis patients and their household contacts.Infect Immun, 1999, 67(11):5967-5971.

[3]Lalvani A, Pareek M.A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection.Br Med Bull, 2010, 93:69-84.

[4]Brock I, Welding K, Lillebaek T, et al.Comparison of tuberculin skin test and new specific blood test in tuberculosis contacts.Am J Respir Crit Care Med, 2004, 170(1):65-69.

[5]Ewer K, Deeks J, Alvarez L, et al.Comparison of T-cell-based assay with tuberculin skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in a school tuberculosis outbreak.Lancet, 2003, 361(9364):1168-1173.

[6]Pai M, Kalantri S, Dheda K.New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: part I.Latent tuberculosis.Expert Rev Mol Diagn, 2006, 6(3):413-422.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.014

“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项（2009ZX1004-803）

100050 北京，中国食品药品检定研究院细菌一室

陈保文，Email：bwnchen@yahoo.com.cn

2012-02-24

·调查与研究·