胡春奎，陆建华，陈 昊，熊家祥

(1南方医科大学，广州510515;2广州军区广州总医院;3第三军医大学)

N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)的过度激活是慢性疼痛发生的关键原因之一［1～3］，利用小干扰RNA(siRNA)抑制NMDAR的表达来治疗慢性疼痛是疼痛治疗的研究热点［4，5］。要将siRNA成功导入体内，合适有效的转导工具是关键，对于神经系统而言，寻找合适的载体更具有挑战性。低分子量聚乙烯亚胺(PEI)和胆固醇组成的水溶性脂质体(WSLP)［6～8］的出现为寻求疼痛基因治疗的合适载体带来了机遇。本研究在前期研究结果WSLP可以运载NR1/siRNA沉默PC12细胞NR1基因的基础上［9］，继续探讨了鞘内注射WSLP/siRNA复合物沉默正常SD大鼠脊髓NR1的可行性，为下一步能否进行WSLP/siRNA复合物治疗大鼠慢性疼痛的实验研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠通过广州军区总医院动物中心购买［动物使用许可证号:SYXK(军)2007-033，SYXK(粤)2009-0100;动物质量合格证明编号: 0067400，0076491］。低分子量聚乙烯亚胺(上海晶纯试剂有限公司);胆固醇氯甲酸酯(Sigma);RTPCR试剂盒(TaKaRa);BCA蛋白浓度测定试剂盒增强型(碧云天);Trizol RNA提取液(Invitrogen); NMDAR1-Antibody(兔源，CST);辣根过氧化物酶标记兔抗羊抗体(Santa进口分装)。

1.2 WSLP的合成及其与siRNA的连接 严格根据早先Lee等［7］的方法再加以改进合成WSLP［6］。30 mL无水氯仿中加入100 μL无水三乙胺(TEA)混合后加入3 g PEI，冰上搅拌30 min。1 g胆固醇氯甲酸酯溶入10 mL 0℃氯仿后缓慢倒入先前溶解的PEI中。搅拌过夜，得到黄色黏稠的胶状物。用50 mL 0.1 mol/L HCl将胶状物溶解后，倒入200 mL无水氯仿以去除多余的聚合物和胆固醇，滤纸滤过。重复上述步骤2次，低压冻干得到黄色粉末。siRNA的序列参照文献［4，5］由广州锐博公司设计合成双链NR1/siRNA，正义链:5'-ACCAGGCCAAUAAGCGACATTdTdT-3'，反义链:5'-UGUCGCUUAUUGGCCUGGUTTdTdT-3'。……