康金森，程路峰，杨 建，陶义存，胡 坚

(新疆医科大学，乌鲁木齐830011)

皮肤的衰老是一个复杂的生物学过程。对此学者们有各种解释，如自由基学说、遗传学说、交联学说、免疫学说等，其中自由基学说比较被认同。自由基攻击生物大分子，如脂质、核酸、多聚不饱和脂肪酸等，使其交联或断裂，导致细胞结构和功能的破坏，可在皮肤上形成色斑、皱纹及其他皮肤病变，造成皮肤的衰老［1，2］。因此，减少自由基的产生和清除多余的自由基有可能成为延缓皮肤衰老的方法。甘草黄酮类具有明显的抗氧化、抗炎、抗变态反应、抗病原微生物、抗肿瘤等作用［3］。甘草总黄酮(FG)对四种主要活性氧——超氧阴离子自由基、羟自由基、单线态氧、过氧化氢有清除作用，推测其在延缓皮肤衰老方面可能有潜在的应用价值。2011年5月～2012年5月，我们采用D-半乳糖腹腔注射的方法建立亚急性衰老小鼠模型，然后观察FG对延缓其皮肤衰老的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂、仪器及实验动物 FG(含量88.2%)，D-半乳糖。脂褐质、羟脯胺酸、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒。751光栅分光光度计，RF-540荧光分光光度计，TGL-168高速台式离心机，DK-S24型电热恒温水浴箱。健康昆明种小鼠，雌性，体质量(20±2.0)g，购于新疆医科大学动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及模型建立［4］昆明种雌性小鼠60只，随机分为A、B、C、D、E组，各12只。A组腹腔注射生理盐水(10 mL/kg)、1次/d，B组腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg、1次/d，同时A、B组分别给予等容积蒸馏水灌胃(1次/d);C、D、E组分别给予FG 0.5、0.75、1.5 g/kg灌胃(1次/d)，同时腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg、1次/d;各组小鼠每5 d称重1次，根据体其体质量调整给药剂量。42 d后断颈放血处死各组小鼠，分别取肝脏组织及皮肤组织。

1.2.2 小鼠肝组织中 SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量的测定 ①小鼠肝脏组织SOD活性测定:取肝组织100 mg，用冰生理盐水制成1%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。②小鼠肝脏组织MDA含量测定:称取肝脏组织100 mg，用冰生理盐水制成10%的组织匀浆，离心(方法同上)，取上清液，用硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。③小鼠肝脏组织GSH-Px活性测定:称取肝脏组织10 mg，用冰生理盐水制成10%的组织匀浆，离心(方法同上)，取上清液，用DTNB法测定GSH-Px活性。以上操作均按试剂盒说明书进行。

1.2.3 小鼠皮肤组织中SOD活性及MDA、羟脯氨酸、脂褐质含量测定 取皮肤组织300 mg，用冰生理盐水制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液备检。取制备好的10%皮肤组织匀浆上清用冰生理盐水稀释至1%，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性;取制备好的10%皮肤组织匀浆上清，用硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量;取制备好的10%皮肤组织匀浆上清用冰生理盐水稀释至2%，用氯胺酮法测定羟脯氨酸;取制备好的10%皮肤组织匀浆上清，用荧光法测定脂褐质。以上操作均按试剂盒说明书进行。

1.2.4 小鼠肝脏和皮肤组织的蛋白测定 小鼠肝脏和皮肤组织的蛋白测定采用考马斯亮蓝法。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件。数据比较用F检验及q检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较 检测结果见表1。表1显示，与A组相比，B组小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px活性明显降低，MDA含量增加;与B组相比，C、D、E组小鼠肝脏组织中SOD活性升高，D、E组MDA含量降低、GSH-Px活性升高，与A组相近。

表1 各组小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较(±s)

表1 各组小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较(±s)

注:与 B组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与A组相比，#P＜0.01

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2.2 各组小鼠皮肤组织SOD活性及MDA、羟脯氨酸、脂褐质含量比较 检测结果见表2。表2显示，与A组相比，B组小鼠皮肤组织中SOD活性下降、羟脯氨酸含量降低，而MDA和脂褐质的含量明显增加。与B组相比，C、D、E组小鼠皮肤组织中SOD活性增强、羟脯氨酸含量升高，MDA和脂褐质含量明显降低。

表2 各组小鼠皮肤组织SOD活性及MDA、羟脯氨酸、脂褐质含量比较(±s)

表2 各组小鼠皮肤组织SOD活性及MDA、羟脯氨酸、脂褐质含量比较(±s)

注:与 B组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与A组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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3 讨论

在一定时间内连续注射D-半乳糖，可产生拟衰老反应及氧自由基代谢的损伤，与人体衰老的改变基本一致［5］。自由基的累积损伤是皮肤衰老的重要原因，是导致标志皮肤衰老的脂褐质、黑色素和蜡样质沉积的重要因素;自由基堆积还可使具有合成胶原能力的成纤维细胞受损，胶原蛋白合成减少，细胞内羟化酶失去羟化功能，羟脯氨酸的生成减少，导致皮肤松弛、皱纹增多。SOD是体内重要的自由基清除剂，是惟一能特异性清除衰老启动因子O2－的抗氧化酶，提高SOD活性可抑制脂褐质的沉积。GSH-Px也是体内重要的抗氧化酶，能特异地催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，保护细胞膜结构和功能的完整性。MDA的水平往往可反应活性氧的损伤效应［6，7］。

本实验结果表明，FG可明显提高衰老小鼠肝组织中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量;可显著提高衰老小鼠皮肤组织中SOD活性及羟脯氨酸含量，降低皮肤MDA和脂褐质的含量。表明FG具有一定的延缓皮肤衰老的功效。其作用机制可能是通过提高SOD、GSH-Px活性，增强机体抗氧化能力即增强清除自由基的能力，进而抑制自由基反应，从而抑制脂质过氧化产物MDA以及脂褐质的生成和积聚，减轻了对成纤维细胞和胶原蛋白的损害。

据报道［8］，FG在体外具有直接清除活性氧自由基的作用，并能抑制脂质过氧化反应。FG在动物体内的抗氧化途径可能有两种:一种是FG直接清除过多的自由基;另一种是FG通过提高动物抗氧化酶活力的间接作用来清除自由基。本实验结果表明后一种可能途径是存在的，至于其延缓皮肤衰老的作用是否和直接清除体内自由基有关尚待进一步的实验来证实。

［1］赵俊超.皮肤衰老机制及抗衰老研究进展［J］.中国老年学杂志，2008，28(12):1146-1148.

［2］来吉祥，何聪芬，董银卯.皮肤衰老机理及延缓衰老化妆品的研究进展［J］.中国美容医学，2009，18(8):1208-1212.

［3］季宇彬，姜薇，范玉玲，等.甘草黄酮的研究进展［J］.中草药，2004，35(9):5-6.

［4］吴正平.红景天多糖对亚急性衰老模型小鼠皮肤衰老的延缓作用［J］.中国老年学杂志，2011，31(5):821-822.

［5］王少康，孙桂菊，张建新，等.亚急性衰老动物模型的建立及评价［J］.东南大学学报(医学版)，2002，21(3):217-220.

［6］张洪泉，余文新.中华抗衰老医药学［M］.北京:科学出版社，2000:82-113.

［7］李素云，王立芹，郑稼琳，等.自由基与衰老的研究进展［J］.中国老年学杂志，2007，27(20):2046-2047.

［8］吴碧华，龙存国，王晓明，等.甘草总黄酮清除自由基作用的体外实验探讨［J］.川北医学院学报，2001，16(1):3-5.