谢高宇 陈 凯 刘浩然 齐敏友 张作涛 (贵阳中医学院基础医学院，贵州 贵阳 55000)

淫羊藿苷对D-半乳糖致衰老大鼠睾丸组织MMP-2及MMP-9表达的影响

谢高宇 陈 凯1刘浩然2齐敏友1张作涛 (贵阳中医学院基础医学院，贵州 贵阳 550002)

目的 观察淫羊藿苷对衰老大鼠睾丸组织基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。方法 SD大鼠30只，随机均分为正常组、模型组、淫羊藿苷(80 mg/kg)组。大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖(200 mg·kg－1·d－1)造成大鼠亚急性衰老模型，同时灌胃给予药物组，每天1次，连续给药8 w。取出各组动物睾丸组织，测血清睾酮含量;取睾丸组织进行病理组织学观察;RT-PCR方法检测MMP-2及MMP-9mRNA表达，免疫组化方法检测睾丸组织MMP-2及MMP-9表达。结果 与正常组比较，模型组血清睾酮水平下降;病理学检测可见生精上皮层变薄，各级生精细胞减少;MMP-2、MMP-9 mRNA与蛋白表达降低。淫羊藿苷组明显改善上述指标(P＜0.01或P＜0.05)。结论 淫羊藿苷对D-半乳糖所致的衰老大鼠睾丸损伤有明显的保护作用，其机制可能与上调MMP-2、MMP-9水平有关。

淫羊藿苷;D-半乳糖;睾丸;基质金属蛋白酶

近年研究表明人体衰老与性腺功能和结构的退化密切相关〔1〕。人体衰老时睾丸形态结构发生退行性病变，如睾丸重量减轻，生精细胞散在分布，支持细胞稀少，精子数目递减，血清睾酮水平下降〔2〕。淫羊藿是一种传统的补益中药，具有补肾阳、强劲骨、祛风湿等多种功效〔3〕。其主要有效成分是淫羊藿苷，属黄酮类化合物，具有调节内分泌、延缓性腺衰老的作用〔4〕。前期的研究表明淫羊藿苷对衰老小鼠睾丸具有明显的促进睾酮释放及抗氧化作用〔5〕，但是否能通过上调睾丸组织基质金属蛋白酶的表达，调节细胞外基质(ECM)降解和合成来保护睾丸尚无报道。本研究拟观察淫羊藿苷对衰老大鼠睾丸组织基质金属蛋白酶(MMP)-2及MMP-9表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 SD雄性健康大鼠，体重180～200 g(浙江医学科学院实验动物中心提供)。合格证号:SCXK(浙)2008-0033。

1.2 药物及试剂 淫羊藿苷，由西安小草植物科技有限公司提供，淡黄色粉末，纯度98.25%(HPLC检测);睾酮检测试剂盒，由天津九鼎生物工程有限公司提供;兔抗大鼠 MMP-2、MMP-9抗体，武汉博士德公司提供。

1.3 主要仪器 紫外分光光度计、离心机(巩义市英峪予华仪器厂);电子天平(型号104，Mettler-Toledo公司);恒温水浴箱(型号WB22，德国)，石蜡切片机(日本日立公司);Image-Pro Plus 5.0图像分析软件。

1.4 方法 大鼠随机分为3组:正常组、模型组、淫羊藿苷组。除正常组外，模型组和淫羊藿苷组连续8 w每天皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg)，正常组注射同体积生理盐水。在以上处理的同时，淫羊藿苷组每天灌胃淫羊藿苷80 mg/kg，正常组和模型组每天灌胃给予同体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。

1.5 检测指标

1.5.1 一般情况 观察造模后各组大鼠体重、精神状态、毛发等情况。

1.5.2 血清睾酮 将血标本离心10 min(2 000 r/min)，取血清，按试剂盒说明测睾酮。

1.5.3 病理组织学 取右侧睾丸组织以10%中性甲醛固定，沿其长轴垂直于曲细精管走向剖开，经石蜡包埋切片，HE染色，于光镜下观察。

1.5.4 免疫组织化学染色 取各组大鼠睾丸组织石蜡包埋，4μm切片，烤片2 h，常规脱蜡处理，3%H2O2处理清除内源性过氧化物酶，抗原热修复。正常山羊血清封闭后，分别滴加兔抗大鼠MMP-2、MMP-9多单克隆抗体(1∶50)4℃孵育过夜。滴加Envision工作液(武汉博士德公司，1∶50)室温30 min。DAB显色，镜下控制显色程度后水洗。苏木素衬染，经二甲苯透明后中性树胶封片。定量分析:在高倍显微镜下(×400)随机选取精曲小管，用Image-Pro Plus5.0彩色病理图像分析软件进行分析。测定免疫组化阳性颗粒的平均光密度值，并计算8个视野吸光度的均值，对MMP-2、MMP-9表达行半定量分析。

1.5.5 RT-PCR检测睾丸组织MMP-2、MMP-9 mRNA表达取睾丸组织100 mg，加液氮研碎后，按Trizol说明书进行总RNA提取。用各自引物(金思特科技有限公司)，引物序列:MMP-2正义链:5'-CCCAGAAAAGATTGACGC-3';反义链:5'-CGACAGCATCCAGGTTAT-3';扩增条件 94℃，40 s;60℃，40 s;72℃，60 s;33个循环。MMP-9正义链:5'-CGTGGCCTACGTGACCTATG-3';反义链:5'-GGATAGCTCGGTGGTGTCCT-3';扩增条件94℃，40 s;64℃，40 s;72℃，60 s;36个循环。GAPDH正义链:5'-GCTGGGGCTCACCTGAAGGG-3';反义链:5'-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3';扩增条件 94℃，40 s;56℃，40 s;72℃，60 s;30个循环。以GAPDH基因为内参照，分别进行MMP-2、MMP-9的RT-PCR扩增。15 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察并用Image Master软件分析条带光密度值，分别计算MMP-2、MMP-9与GAPDH光密度值比值。

2 结果

2.1 一般情况 模型组大鼠与正常组比较，体重明显减轻，精神差，毛发脱落。淫羊藿苷组较模型组体重增加，精神状态好，毛发光泽。见表1。

2.2 对大鼠血清中睾酮的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清睾酮水平明显下降(P＜0.01)，而淫羊藿苷可显著提高血清中睾酮活性(P＜0.01)。见表1。

表1 对D-半乳糖衰老大鼠体重及睾酮水平的影响(±s，n=8)

表1 对D-半乳糖衰老大鼠体重及睾酮水平的影响(±s，n=8)

与正常组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01，下表同

组别 体重(g) 睾酮(nmol/L)311.5±18.1 11.85±0.83模型组 256.6±8.11) 7.6±0.591)淫羊藿苷组 281.9±10.62) 9.75±0.642)正常组

2.3 对睾丸病理改变的影响 睾丸组织HE染色，于光镜下观察。结果表明:正常组小鼠睾丸支持细胞与各级生精细胞正常，管腔中精子可见;模型组睾丸各级生精细胞显著减少，支持细胞少，细胞排列紊乱，精子数量大量减少。淫羊藿苷组生精细胞相对模型组增多，排列较为整齐，管腔中可见精子，与正常组较为接近。

2.4 睾丸组织中MMP-2及MMP-9的表达 免疫组化结果显示，正常组MMP-2和MMP-9蛋白阳性表达主要见于圆形精子细胞以及支持细胞的胞质。与正常组比较，模型组表达显著减少，淫羊藿苷组的表达与模型组比较明显降低。见表2。

表2 睾丸组织中MMP-2及MMP-9的表达(±s，n=4)

表2 睾丸组织中MMP-2及MMP-9的表达(±s，n=4)

组别0.292±0.056 0.321±0.052模型组 0.158±0.0391) 0.166±0.0411)淫羊藿苷组 0.241±0.0422) 0.292±0.0542)MMP-2 MMP-9正常组

2.5 睾丸组织中MMP-2及MMP-9 mRNA的表达 与正常组相比，模型组MMP-2及MMP-9 mRNA表达均显著下降(P＜0.01);淫羊藿苷组可显著升高模型组MMP-2及MMP-9 mRNA表达(P＜0.05或P＜0.01)。见图1、表3。

图1 睾丸组织中MMP-2、MMP-9 m RNA的表达

表3 睾丸组织中MMP-2及MMP-9 mRNA表达(±s，n=4)

表3 睾丸组织中MMP-2及MMP-9 mRNA表达(±s，n=4)

组别1.12±0.10 1.62±0.18模型组 0.73±0.151) 1.01±0.271)淫羊藿苷组 1.07±0.152) 1.32±0.142)MMP-2 MMP-9正常组

3 讨论

D-半乳糖所致衰老动物模型是目前应用最多的衰老模型之一，其所致模型稳定可靠，造模方法简易，在抗衰老药物研究等领域得到广泛应用〔6〕。研究发现D-半乳糖可导致大鼠血清睾酮降低及睾丸结构发生改变。本实验采用此法建立大鼠衰老模型。造模后衰老模型组大鼠体重明显下降、精神差，可见明显毛发脱落，血清睾酮含量的明显下降，且睾丸组织形态学改变证实该模型建造成功。

MMPs与ECM之间的失衡可能是导致睾丸内部微环境改变，从而导致睾丸病变的重要机制之一。MMP-2、MMP-9是MMPs家族中降解基底膜最重要的蛋白酶，由多种细胞以酶原形式在细胞内合成从而分泌到细胞外，并在多种因素的调控下作用与ECM而发挥酶解效应〔7〕。在睾丸中，ECM主要集中与曲细精管外周界膜上。MMP-2和MMP-9作为调节ECM平衡的主要因素之一，与此界膜关系密切〔8〕。本研究提示淫羊藿苷最终通过上调MMP-2与MMP-9途径发挥其睾丸保护作用，但其作用机制尚有待进一步研究。

1 黄和贤，曹文富，彭 爽，等.延衰合剂对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠睾丸及血清睾酮的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(12):2239-42.

2 Ponholzer A，Plas E，Schatzl G，et al.Association of DHEA-S and estradiol serum levels to symptoms of agingmen〔J〕.Aging Male，2002;5(4):233-8.

3 章振保，田生平，杨镜秋，等.淫羊霍苷与睾酮治疗亚急性衰老雄性大鼠的实验研究〔J〕.中国男科学杂志，2006;20(8):13-8.

4 李秀英，徐晓玉.淫羊藿苷的药理作用研究进展〔J〕.云南中医中药杂志，2007;28(6):45-6.

5 陈 凯，刘浩然，苏燕慧，等.淫羊藿苷对D-半乳糖致衰老模型小鼠睾丸病变的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(10):1816-8.

6 朱亚珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老动物模型的建立及其检测方法〔J〕.复旦学报(医学版)，2007;34(4):617-9.

7 谭善峰，郭丰富，顾润国.MMP-2、MMP-9及TIMP-1在人睾丸精原细胞瘤组织中的表达及意义〔J〕.山东医学高等专科学校学报，2006;28(6):401-4.

8 Longin J，Le Magueresse-Battistoni B.Evidence thatMMP-2 and TIMP-2 are at play in the FSH-induced changes in Sertoli cells〔J〕.Mol Cell Endocrinol，2002;189(2):25-6.

Effect of Icaririn on expression of MMP-2and MMP-9of testis tissue in D-galactose-induced aging rats

XIE Gao-Yu，CHEN Kai，LIU Hao-Ran，et al.
Pharmacology College of Guiyang College of Traditional Chinese M edicine，Guiyang 550002，Guizhou，China

Objective To investigate the effect of Icaririn on expression of MMP-2 and MMP-9 of testis tissue in D-galactose-induced aging rats.M ethods 30 SD ratswere random ly divided into three groups:normal，modeland Icaririn group(80mg/kg).The subacute agingmodel of ratswere induced by D-galacotose(200 mg·kg－1·d－1)following s.c.administration，at the same time，Icaririn was given i.g.for8 weeks.Testes ofeach group were removed from the scrotum.Serum level of testosteronewasmeasured respectively.Testicular tissuemorphology was observed by lightmicroscopy.The expressions of MMP-2 and MMP-9 mRNA in testis tissue were examined using RT-PCRmethod.The expressions of MMP-2 and MMP-9 antibodies were also immunohistochemically investigated.Results Compared to the control group，the level of serum testosterone in testis was decreased in model group.The histopathological examination suggested that seminiferous tubule diameters and various grade of spermatocytes in the testismarkedly shrunk.Compared with controlgroup，the expressions of MMP-2 mRNA，MMP-2 protein and MMP-9 mRNA，MMP-9 protein were significantly increased in model group.These alterations were significantly attenuated in Icariin group(P＜0.01).Conclusions Icariin can evidently relieve testicular damage in D-galactose-induced aging rats，whichmight be related to improve the expressions of MMP-2 and MMP-9.

Icariin;D-galactose;Testis;Matrixmetalloproteinase

Q285

A

1005-9202(2012)16-3458-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.051

贵州省科技厅(黔科合中药〔2011〕LKZ7032号)

1 浙江工业大学 2 湖南大学化学化工学院

张作涛(1953-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事中西医结合基础研究。

谢高宇(1970-)，男，讲师，主要从事病理组织学研究。

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〔2011-10-26收稿 2011-12-31修回〕

(编辑 曹梦园)