王淑强 郭 颖 李海军 张林西 李玉珍 郝秀轻 (河北北方学院病理教研室，河北 张家口 075000)

苦参碱诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其对Bax表达的影响

王淑强 郭 颖 李海军 张林西 李玉珍 郝秀轻 (河北北方学院病理教研室，河北 张家口 075000)

目的探讨苦参碱在体外诱导乳腺癌MCF-7细胞的凋亡作用及其机制。方法用MTT方法检测乳腺癌MCF-7细胞生长抑制率，用流式细胞仪(FCM)分别检测MCF-7细胞凋亡情况，MCF-7细胞线粒体跨膜电位及MCF-7细胞Bax蛋白表达情况。结果苦参碱对乳腺癌MCF-7细胞生长抑制率测定结果显示，不同浓度的苦参碱对MCF-7细胞生长抑制率与对照组相比存在明显差异(P＜0.05)，呈剂量-效应正相关及时间-效应正相关，流式细胞仪检测MCF-7细胞凋亡，与对照组相比均有显著差异(P＜0.05)，随着苦参碱浓度的增高，凋亡的发生率也相应提高，呈正相关。线粒体跨膜电位检测，苦参碱处理组MCF-7细胞罗丹明染色阳性数明显低于对照组，存在显著差异(P＜0.05)，并随苦参碱浓度的增高而减少，呈负相关。流式细胞仪检测Bax蛋白表达显示，Bax蛋白表达上调，与对照组相比，存在显著差异(P＜0.05)，且随作用浓度增高表达增强，呈正相关。结论中药苦参碱在体外能抑制乳腺癌MCF-7细胞之生长抑制，并能诱导该细胞凋亡。

苦参碱;细胞凋亡;MCF-7cells;体外诱导

苦参碱是从传统中药中分离出的一种生物碱，是中药苦参的主要有效成分，属于四环的喹诺里丙啶类。大量的药理和临床研究发现，苦参碱具有抗炎，抗病毒，抗纤维化，免疫调节等多种药理作用〔1〕。近年来，有人发现苦参碱还具有抗肿瘤的作用，可抑制肿瘤细胞增殖和转移，促进凋亡，诱导肿瘤分化，对肝癌、肺癌、胃癌、大肠癌、食管癌和乳腺癌等多种癌细胞具有抑制作用〔2，3〕。本研究探讨苦参碱对乳腺癌MCF-7细胞的抑制和诱导细胞凋亡作用及对凋亡抑制基因Bax表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 苦参碱购自北京双鹭药业股份公司，乳腺癌细胞株MCF-7由我院中心实验室提供，RPMI-1640培养液，细胞凋亡罗丹明123染色试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，新生胎牛血清购自天津市川页生化制品有限公司。胰酶、四甲基噻唑蓝MTT购自北京普京康生物工程有限公司。FITCBax蛋白抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，SW-GJ-2FD型超净工作台，3319型CO2培养箱，BDFACS-Aria流式细胞仪。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及传代 将冻存的乳腺癌细胞株MCF-7，从－176℃ 液氮罐中取出，快速放入37℃ ～42℃左右水浴箱中快速解冻，融化后将冻存管置于离心机离心，1 500 r/min，离心7 min，将离心后的冻存管在超净台内打开，弃去冻存液后加入2 ml配置好的RPMI-1640培养液，用吸管轻轻吹打悬浮细胞后将培养液移入培养瓶内，将培养瓶内培养液加至4～5 m l，放入37℃ 5%CO2培养箱内孵育。细胞培养24 h后，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，细胞占瓶底80%左右即可进行传代培养，弃去培养液后加入消化液约2 m l左右进行消化，在倒置显微镜下观察，细胞开始收缩细胞间出现裂隙，尚未完全变圆前，即可终止消化，弃去消化液后加入新鲜培养液，轻轻吹打贴壁细胞，直到完全悬浮后，均分移入培养瓶内进行细胞培养，然后继续在37℃ 5%CO2培养箱内孵育。

1.2.2 苦参碱对MCF-7细胞生长抑制率MTT实验方法 取对数期生长的乳腺癌MCF-7细胞，用0.25%胰酶消化加培养液轻轻吹打悬浮细胞，将浓度调到2×104个/ml，每孔100μl接种于96孔板内，培养24 h，观察细胞贴壁且生长良好后，分别加入 100μl苦参碱溶液使其浓度分为 0.25、0.5、1.0、2.0 mg/m l作为实验组，另外加入与实验组等量的培养液作为对照组，各设4个复孔。37℃ 5%CO2培养箱内继续孵育。苦参碱作用24、46、72 h后进行MTT检测，检测前每孔加入100μl DMSO，轻轻振荡，溶解约10～15 min后，用酶标仪测定吸光度。选择492 nm测量波长。计算出每个时间段中对照组与实验组4个复孔的平均吸光度值，代入下列公式计算。计算公式:肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1－实验组吸光度/对照组吸光度)×100%。上述实验重复三次，进行数据统计分析。

1.2.3 细胞凋亡的检测 取实验组和对照组细胞，弃去培养液，胰酶消化，加预冷的PBS洗涤，轻轻吹打贴壁细胞使之悬浮。收集细胞于尖底离心管内离心(1 500 r/min，7min)并调整细胞数为1×105个，相同方法PBS洗涤两次，两次离心前先将细胞移入流式测定管内，离心后流式测定管内加入100μl结合缓冲液悬浮细胞，相继加入5μl Annexin V/FITC和10μl碘化丙啶溶液(20μg/ml)，混匀后室温下避光孵育15 min，加入400μl结合缓冲液及时上流式细胞仪分析。

1.2.4 线粒体跨膜电位的检测 选取对数生长期MCF-7细胞5瓶，选取其中4瓶分别加入含培养液的苦参碱4 ml，苦参碱浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml为实验组，取1瓶加入等量培养液为对照组。细胞37℃ 5%CO2培养箱内孵育24 h。药物作用24 h后细胞经0.25% 胰酶消化重悬于培养液中，取细胞数为1×106个/m l，加入罗丹明123染液10μg/ml 37℃5%CO2培养箱孵育20 min离心，培养液洗细胞两次，上流式细胞仪检测。

1.2.5 Bax蛋白的检测 实验分24 h和48 h组，均随机自选对数生长期MCF-7细胞5瓶，选取其中4瓶分别加入含培养液的苦参碱 4 ml，苦参碱浓度分别为 0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml为实验组，取1瓶加入等量培养液为对照组。37℃ 5%CO2培养箱内孵育。药物作用24 h和48 h后，将细胞0.25%胰酶消化，弃去消化液，加预冷的PBS洗涤，轻轻吹打贴壁细胞使之悬浮，收集细胞于尖底离心管内离心(1 500 r/min 7 min)并调整细胞数为1×105个，相同方法PBS洗涤两次，二次离心前先将细胞移入流式测定管内离心，离心后24 h和48 h各实验组和对照组均加入Bax单克隆抗体100μl，混匀后室温下避光孵育30 min，上流式细胞仪(FACS)分析。

2 结果

2.1 苦参碱对MCF-7细胞生长的抑制率 苦参碱作用于乳腺癌MCF-7细胞24、48和72 h的生长抑制率分别为:6.61% ～35.58%、7.97% ～51.56%和11.98% ～68.31%。从表1看出，在24、48 h两个实验组中除了0.25 mg/ml及0.5 mg/ml这两个低浓度组在组内比较无显著差异(P＞0.05)外，包括72 h在内的实验各组，组内各浓度之间苦参碱对MCF-7细胞的抑制率比较，均存在显著差异(P＜0.05)，苦参碱对MCF-7细胞的生长抑制率随药物浓度的增加而增高，呈剂量-效应正相关，并且随时间的延长其抑制率也相应提高，呈时间-效应正相关。见表1。

表1 苦参碱对MGF-7细胞的抑制率(±s，%)

表1 苦参碱对MGF-7细胞的抑制率(±s，%)

与前一浓度比较:1)P＜0.05;与上一时间点比较:2)P＜0.05

时间点0.25 mg/ml 0.5 mg/m l 1.0 mg/ml 2.0 mg/m l 24 h 6.61±0.50 7.67±0.64 19.50±2.12 35.58±1.38 48 h 7.97±0.41 9.61±0.67 32.56±1.602) 51.56±1.722)72 h 11.98±1.11 17.14±1.211)54.46±2.931)2)68.31±2.131)2)

2.2 苦参碱对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响 苦参碱处理MCF-7细胞24 h后，用双标法AnnexinV和PI对MCF-7细胞标记后经流式细胞仪检测，结果显示:苦参碱对MCF-7细胞有明显的凋亡促进作用，实验组凋亡发生率对于4.17%～19.63%之间，与对照组 〔(1.10±0.08)%〕相比，均有显著差异 (P＜0.05)。药物各浓度组之间相比也存在显著差异(P＜0.05)，并随药物浓度的提高，0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml苦参碱组凋亡的发生率也相应增高，分别为(4.17±0.25)%、 (6.60±0.18)%、 (15.32±0.21)%和(19.63±0.17)%，且呈正相关。

2.3 线粒体膜电位的检测结果 苦参碱处理MCF-7细胞24 h，罗丹明123经流式细胞仪检测，结果显示，苦参碱处理MCF-7细胞罗丹明染色阳性数明显低于对照组，与对照组〔(83.00±1.42)%〕相比有明显差异 (P＜0.05)，并随苦参碱作用浓度的增高而减少，为负相关。0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml苦参碱组线粒体膜电位分别为 (66.03±2.08)%、(61.28±1.29)%、 (60.55±0.87)%及 (56.30±1.87)%。0.5和1.0 mg/ml两个浓度组相比较无明显差异 (P＞0.05)外，各浓度组之间均有明显差异 (P＜0.05)，因罗丹明染色阳性细胞数的变化反映了线粒体膜电位的变化，具有一致性。换言之，实验组乳腺癌MCF-7细胞线粒体跨膜电位显著低于对照组，随作用药物浓度的增加而下降程度加大，呈负相关。

2.4 苦参碱对MCF-7细胞Bax表达的影响 苦参碱作用于MCF-7细胞24 h、48 h后实验组Bax蛋白阳性表达率分别介于0.80% ～11.93%和1.15% ～16.83%，均高于对照组，与对照组相比差异显著(P＜0.05)，各浓度组间比较Bax蛋白阳性表达也存在显著差异，且Bax蛋白表达随药物作用浓度增高表达增高，呈正相关。见表2。

表2 苦参碱对MCF-7细胞Bax表达的影响(±s，%)

表2 苦参碱对MCF-7细胞Bax表达的影响(±s，%)

与对照组比较:1)P＜0.05

时间点 对照组0.25 mg/m l 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml 2.0 mg/m l 24 h 0.38±0.05 0.80±0.821)1.30±0.821)6.30±0.081)11.93±0.341)48 h 0.43±0.05 1.15±0.131)2.73±0.171)10.45±0.641)16.83±0.821)

3 讨论

苦参碱作为多种中药的有效成分之一，已被证明具有重要的生物学活性，如抗癌、抗病毒、抗纤维化、免疫调节等多种药理作用，体外实验表明苦参碱对多种肿瘤细胞有抑制或杀伤作用，对HEPG2、K562、HL260有明显的抑制作用，并能诱导分化和凋亡〔4，5〕。Hua 等〔6〕的研究表明，苦参碱可诱导细胞色素 C释放、激活caspase-3和caspase-9从而通过线粒体途径诱导K562细胞凋亡。

本研究发现苦参碱对乳腺癌MCF-7细胞有明显的生长抑制作用，随苦参碱的作用浓度增高作用时间延长，对乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用也增强。不同的凋亡指数(AI)，即凋亡细胞占细胞总数的百分比，在一定程度上与其对放、化疗的敏感性、肿瘤分化程度、分级、发展及肿瘤的生物学行为有关。诱导肿瘤细胞发生凋亡是目前进行肿瘤控制与治疗的可行方法之一，也是筛选抗癌药物的指标之一。

本结果中MCF-7细胞凋亡率与王利民〔7〕报道的同浓度下苦参碱作用青肉瘤QS732细胞，检测的凋亡率9.8%、16.9%相近，但高于马玲娣等〔8〕报道的苦参碱作用与小鼠H22肝癌细胞检测值4.32%和11.27%，这说明不同的肿瘤细胞对苦参碱的敏感性不同，可能触发癌细胞凋亡机制也大不相同。

罗丹明123是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂，其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失，而在凋亡发生时，线粒体膜完整性被破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位的崩解。Rh123从新释放出线粒体，从而发出黄绿色荧光，可用流式细胞仪检测。通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化和凋亡的发生。研究表明线粒体膜电位的降低和去极化可停止合成ATP，使能量代谢受损，从而导致线粒体膜通透性开放，细胞发生凋亡〔9〕。本实验结果推测苦参碱可能影响了线粒体跨膜电位MMP通道的结构，导致MMP通道开放，触发凋亡的发生，也可能改变了线粒体膜内外两侧的某些离子使跨膜电位崩溃，MMP通道开放，位于内外膜上的许多离子会逆流，均有可能触发凋亡的产生。我们的实验证实苦参碱能够降低线粒体跨膜电位，诱导乳腺癌MCF-7细胞的凋亡，由哪种途径引起有待进一步探讨。

Bax家族是细胞内重要的内源性细胞凋亡抑制物成员之一，这些抑制物制约细胞凋亡机器的运行，维持细胞的正常生存，在细胞凋亡调控机制方面，Bax是迄今研究的最深入、广泛的凋亡调控基因之一。Bax是一种细胞内膜蛋白，主要定位于线粒体、内质网和核膜。研究显示Bax能够通过下列途径维持细胞正常，防止凋亡的发生。①如细胞氧化，还原状态(如增加GSH，抑制ROS的产生与活化，增强过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性等)，浆膜的变化(抑制磷酸酯酰丝氨酸外翻)，细胞内离子抑制(抑制Ca2+自内质网外流和向核外流，防止胞浆酸化)，抑制 caspase-3的活化等。②Bax与Bcl-2能够抑制MMP开放和维持膜电位，进而阻止线粒体内cyto C和AIF的释放，也有人认为Bax与P53依赖的凋亡信号途径重要中介物之一〔10，11〕。本实验结果推测苦参碱可能通过某种途径激活Bax基因并促进Bax蛋白合成，并从胞浆移至线粒体外膜，形成多聚体或高度有序的寡聚体，启动MMP通道开放，使线粒体跨膜电位下降或崩溃，启动凋亡程序，一起凋亡。另外，Bax的高表达也可能增强了某种凋亡信号，引发P53作用增强，从而诱导细胞凋亡，移至细胞增殖。

综上，苦参碱通过多种环节，不同途径和方式对肿瘤细胞有较强的抑制作用，促进肿瘤细胞凋亡，诱导分化，这种作用不是单一和独立的，有可能是极为复杂，互相关联，互相促进，甚至是多种因素综合作用的结果。由此可见，苦参碱是极具前途的抗肿瘤中药活性成分，尤其是对人乳腺癌细胞MCF-7细胞具有现实意义，因而具有广阔的药物研发和临床应用前景。

1 王晓燕，梁 磊，邓虫珠，等，苦参碱体外诱导人结肠腺癌SW620细胞的凋亡的实验研究〔J〕.南方医科大学学报，2008;28(3):432-5.

2 Zhang LP，Jinang JK，Taw TW，et al.Effect of matrine on proliferation and differentiation in K-562 cell〔J〕.Leuh Res，2001;25(9):793-800.

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7 王利民.苦参碱诱导胃肉瘤细胞凋亡的实验研究〔J〕.实验诊断与治疗杂志，2004;18(5):391-2.

8 马玲娣，张 彦，何於娟，等.苦参碱对小鼠H22肝癌细胞凋亡作用的实验研究〔J〕.肿瘤，2007;27(8):600-6.

9 Wisor JP，Nishino S，Sora I，etal.Dopaminergic role in stimulant-induced wakefulness〔J〕.Neuroscience，2001;21(5):1787-94.

10 Zhang L，Yu J，Park BH，etal.Role of BAX in the apoptotic response to anticancer agents〔J〕.Science，2000;290:989-92.

11 Ke N，Godzik A，Reed JC.Bcl-B，a novel Bcl-2 familymember that differentially binds and regulates Bax and Bak〔J〕.JBiol Chem，2001;276(16):12481-4.

R285

A

1005-9202(2012)16-3489-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.067

王淑强(1960-)，女，高级实验师，主要从事肿瘤学研究。

〔2011-03-03收稿 2011-07-30修回〕

(编辑 曹梦园)