向熙 刘卫青 余艺 王栋 陈晓岗

急慢性注射地卓西平马来酸盐对小鼠额叶m icroRNA-181b表达的影响☆

向熙*刘卫青△余艺△王栋△陈晓岗△*

目的 研究急慢性注射地卓西平马来酸盐（MK-801）对小鼠额叶中与精神分裂症相关的微小RNA（microRNA，miRNA）-181b表达的影响，探讨其参与精神分裂症病理学的可能机制。方法 急性注射实验中40只小鼠随机分成四组，分别腹腔注射不同剂量（0.125 mg／kg，0.25 mg／kg，0.50 mg／kg）的 MK-801 和生理盐水（简称急性对照组），15 min后用实时荧光定量PCR（real-time PCR）技术检测额叶miRNA-181b的相对表达量；慢性注射实验中 22只小鼠随机分成两组，分别腹腔注射 0.25 mg·kg－1·d－1的 MK-801和生理盐水（简称慢性对照组），连续 14 d，然后检测 miRNA-181b 的相对表达量。 结果 急性注射 0.125 mg／kg、0.25mg／kg、0.50 mg／kg MK-801的各组小鼠额叶 miRNA-181b 的相对表达水平分别为 0.65 ± 0.05、 0.61 ± 0.05 和 0.91 ± 0.08。 前两个剂量组 miRNA-181b 的表达明显低于对照组（1.00 ± 0.13），P＜ 0.05，而 0.5 mg／kg的 MK-801 则对 miRNA-181b表达无影响（P＞0.05）。慢性 MK-801注射组 miRNA-181b的相对表达量为 1.86±0.19，显著高于慢性对照组（1.00±0.10），P＜0.05。结论 急性和慢性MK-801对额叶中miRNA-181b表达的影响不同，结合miR-181b的分子功能，提示miRNA-181b在急性和慢性模型鼠的构建中起到不同的作用。

地卓西平马来酸盐 额叶 microRNA-181b实时荧光定量PCR

已有的研究显示，精神分裂症患者脑中多个部位微小 RNA（microRNA，miRNA）的表达异常［1－3］，miRNA能通过转录后沉默机制调控多个基因的表达，因此脑中miRNA水平的微小失调，可能会导致其靶基因参与的分子通路的紊乱［4］。其中，miR-181b在精神分裂症患者的颞上回中表达过量，且能抑制离子型谷氨酸受体AMPA受体亚基2（GluR2）基因的翻译［5］。 谷氨酸信号通路是脑中重要的神经递质传导通路，其功能低下假说是精神分裂症的重要假说之一。然而，谷氨酸功能低下如何造成精神分裂症的一系列症状尚不明了，其是否会导致miR-181b表达的失调，从而影响下游功能蛋白的表达，目前也无报道。非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂地卓西平马来酸盐（MK-801），能在人及动物中较好的模拟精神分裂样行为［6－7］，被广泛的用于制作谷氨酸功能低下的动物模型。因此，本研究采用急、慢性注射MK-801的方法制备此小鼠模型，检测谷氨酸信号通路的紊乱对额叶中miR-181b表达的影响，并结合miR-181b的分子功能，探讨miR-181b在谷氨酸信号通路中起到的调节作用及其参与精神分裂症的可能机制。

1 材料和方法

1.1 动物 成年雄性C57BL／6小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司），实验初期体重为20 g～25 g。实验前所有小鼠在动物房恒温（22±1℃）、湿度 50%～ 55%、12 h 昼夜节律 （8：00－20：00）下适应性饲养5 d，自由饮水及进食。所有小鼠在腹腔注射前每天用手抚摸抓取几次。所有实验均在8：00－19：00之间完成。本实验获得中南大学湘雅二医院实验动物管理委员会批准。

1.2 试剂 MK-801购自美国Sigma-Aldrich公司，用灭菌生理盐水配成1mg／mL的储存液，在实验 前 再 配 制 成 0.0125 mg／mL、0.025 mg／mL、0.05 mg／mL 的工作液。

1.3 小鼠腹腔注射MK-801 急性MK-801注射实验中40只小鼠随机分成四组，每组10只，分别腹腔注 射 0.125 mg／kg、0.25 mg／kg、0.5 mg／kg 的MK-801和生理盐水，注射体积为10mL／kg。注射完成15min后，立即将小鼠断颈取脑，于冰上快速获取额叶部位后，将组织放于液氮中冷激5 s～10 s，置于－70℃冰箱保存待用。

慢性MK-801注射实验中22只小鼠随机分为两组，每组 11 只，分别腹腔注射 0.25mg／kgMK-801和生理盐水，注射体积为10mL／kg，连续注射14 d。0.25mg／kg的剂量不会引起后肢肌力障碍及明显的共济失调等神经毒性表现［14］。最后一次注射完成后15min，立即将小鼠断颈取脑，用同样的方法获取额叶组织并保存。

1.4 额叶m iRNA-181b表达检测 用Trizol试剂提取小鼠额叶组织的RNA，测纯度及完整度，符合实验要求后，用miRNA逆转录试剂盒 （大连宝生物公司）将miRNA逆转录为cDNA，之后采用SybrGreen荧光定量法检测miRNA-181b的相对表达量。计算方法为已报道过的 2-ΔΔCt法［8］。每个模板做两个重复管以计算平均ΔCt值。用于实时荧光定量的 miRNA-181b的下游引物为 5′-AACATTCATTGCTGTCGGTGGGT-3′，内参基因 U6 snRNA的下游引物为 5′-CGGCAGCACATATAC TAAAATTGG-3′。上游引物均为实时荧光定量试剂盒 （大连宝生物公司）提供的Uni-miR qPCR Primer。采用 ABI StepOne Plus实时定量 PCR仪进行检测，根据仪器说明每板40个循环，反应时间温度为 95℃ 30 s预变性后，95℃ 5 s、60℃ 34 s循环 40 次，之后 95℃ 15 s，60℃ 60min，95℃ 15 s绘制溶解曲线。PCR产物的长度用琼脂糖凝胶电泳进行检测鉴定，同时鉴定PCR产物的特异性。

1.5 统计学方法 用SPSS 13.0进行数据分析，所有数据均用平均值±标准误来表示。两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），LSD进行组间两两比较。检验水准α＝0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 急性注射不同剂量MK-801对小鼠额叶中m iR-181b表达的影响 不同剂量MK-801急性注射组与对照组中小鼠额叶miRNA-181b相对表达量的比较见表1。由表1可见，在0.125mg／kg和0.25mg／kg的剂量时，注射完成15min后小鼠额叶中miRNA-181b表达量相对于急性对照组显著降低，分别为急性对照组的 （65±5）%和 （61±5）%，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。 而在 0.5mg／kg的注射剂量时，则与对照组比无统计学差异［为对照组的（91 ± 8）%，P ＞ 0.05］。

2.2 慢性注射 MK-801对小鼠额叶中 m iRNA-181b表达的影响 连续14d慢性注射MK-801（每天 0.25mg／kg）， 导致小鼠额叶 miRNA-181b 表达的变化见表 2。表 2显示0.25mg／kg MK-801的慢性注射组，miRNA-181b相对于慢性对照组显著升高，是慢性对照组的（186±19）%，差异有统计学意义（t＝ －4.13，P ＜ 0.01）。

3 讨论

最近的研究表明，精神分裂症可能与患者脑部 miRNA 的表达异常有关［2，9－11］。 本研究利用谷氨酸功能低下的小鼠模型，以miRNA-181b为对象，探讨了谷氨酸信号通路与额叶中miRNA-181b表达的关系。结果显示，急性注射中低剂量的MK-801使小鼠额叶miRNA-181b表达显著减少。体外细胞转染实验和荧光素酶报告基因检测证实，miRNA-181b作用的靶基因为离子型谷氨酸AMPA受体亚基2（GluR2）。急性阻断谷氨酸受体（包括NMDA受体和AMPA受体）后，可能由于反馈性机制引起相关的miRNA（如miRNA-181b等）表达下调［12］。由miRNA的转录后沉默机制可知，额叶中miRNA-181b表达的下调，会使GluR2蛋白表达受到的抑制减少。GluR2是谷氨酸AMPA受体的一个重要组成型亚基，其存在对于AMPA受体的转运和装配有重要作用［13］。因此，GluR2表达的增多，会提高离子型谷氨酸AMPA受体在皮层细胞膜表面转运和装配的效率，从而增强额叶部位的谷氨酸功能。

表1 不同剂量MK-801急性注射组与对照组中小鼠额叶m iRNA-181b相对表达量的比较（±s）

表1 不同剂量MK-801急性注射组与对照组中小鼠额叶m iRNA-181b相对表达量的比较（±s）

1）与急性对照组比较，经 LSD检验，P＜0.05

组别0.125mg ／kg MK-801 0.25mg／kg MK-801 0.5mg ／kg MK-801急性对照组n 10 10 10 10 miR-181b相对表达量0.65 ± 0.051）0.61 ± 0.051）0.91 ± 0.08 1 ± 0.13

表2 慢性MK-801注射组与对照组中小鼠额叶m iR-181b相对表达量的比较（±s）

表2 慢性MK-801注射组与对照组中小鼠额叶m iR-181b相对表达量的比较（±s）

1）与急性对照组比较，经 LSD检验，P＜0.05

组别慢性MK-801组慢性对照组n 11 11 miR-181b相对表达量1.86 ± 0.191）1.00 ± 0.10

这些急性剂量的MK-801注射引起的动物行为学异常，如自发活动增加和刻板行为［14］，一般会持续2～ 3 h［15］。 在这一过程中，miRNA-181b 下调引起的下游GluR2表达的增加，对于急性MK-801刺激诱发的动物行为学异常可能起到抵抗和缓解作用。

高剂量 MK-801 （0.5mg／kg） 时 miRNA-181b表达并不改变。已有的研究证明，慢性注射不同剂量的 MK-801（0.01 mg／kg～ 1mg／kg）会导致大鼠前额叶皮质中NMDA受体的亚基 （NR1，NR2A～D）mRNA水平呈倒U型曲线变化［6］。类似于该研究，我们推测，不同剂量的MK-801对额叶中miRNA-181b表达的调节可能是呈正U型曲线变化的，中低剂量的MK-801使miRNA-181b表达下调，随后随着注射剂量的增加而表达增加，0.5mg／kg的剂量可能正好处于不改变miRNA表达的剂量范围。然而不改变miRNA表达的低剂量端我们尚未实验。对于这一点还需进一步的实验研究。

连续14 d的慢性注射MK-801除阻断NMDA受体外，可致额叶miRNA-181b显著上调，具体机制不明。慢性注射组中该miRNA的表达上调，会降低额叶皮层细胞离子型谷氨酸AMPA受体的水平，同时通过直接阻断NMDA受体，从而降低额叶部位谷氨酸功能。该结果与Beveridge等在精神分裂症患者脑颞上回中报道的结果一致［1］，提示我们在分子水平慢性MK-801注射能更好的模拟精神分裂症。 前人的研究表明［16－17］，慢性注射诱发的动物模型，在给药完成后的很长一段时间，也能持久并稳定的模拟类精神分裂行为。因此，慢性MK-801刺激所诱发的持久并稳定的动物行为学异常，可能是药物空间阻断NMDA受体通路和扰乱miRNA-181b表达并最终降低离子型谷氨酸AMPA受体水平这两者双重作用的结果。

急慢性注射MK-801导致小鼠额叶中miRNA-181b呈现相反的变化趋势，虽然机制尚未知，但类似的研究可以提供一些参考依据。Zuo等［16］及Tsukada等［18］分别在对小鼠及猴子的研究中发现，急性MK-801会使前额叶皮质中外谷氨酸和多巴胺的释放增多，而慢性MK-801会使二者的释放减少，该机制也尚未知。因此推测，急性和慢性MK-801导致的miRNA-181b的不同变化，可能与额叶中胞外谷氨酸和多巴胺水平有关，且可能呈负相关。这些研究及本实验结果反映了急性和慢性MK-801构建的动物模型在分子表达及脑中谷氨酸、多巴胺的释放水平上存在的差异。

由本研究可知，谷氨酸信号通路的紊乱会导致额叶中miRNA-181b表达变化，且急性和慢性MK-801对miRNA-181b的表达影响不同，提示miRNA-181b在急性和慢性模型鼠的构建中起到不同的作用。急性注射采用的MK-801的剂量可能缺乏代表性，进一步的研究需要增加急性注射剂量的梯度，以探讨不同剂量的MK-801对miRNA-181b的表达影响呈何种变化趋势。另外，胞外谷氨酸或多巴胺的释放与额叶中部分miRNA表达的关系，也是我们需要进一步研究的课题。

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The effects of acute and chronic dizocilpine maleate exposure on the expression of m icroRNA-181b in the mouse frontal cortex.

XIANG Xi，LIU Weiqing，YU Yi，WANG Dong，CHEN Xiaogang.Institute of Genomic Medicine，Wenzhou Medical College， 82 Xueyuan Road， Wenzhou 325000.Tel： 0577－88830225.

ObjectiveTo explore the effects of acute and chronic dizocilpine （MK-801） exposure on the expression ofmicroRNA（miR）-181b， a schizophrenia-associated microRNA， in the frontal cortex ofmouse brain and its potential role in the pathogenesis of schizophrenia.M ethods In the acute experiment， forty mouse were divided into four groups random ly， the MK-801 and control groups were given intraperitoneal injection of different doses of MK-801 （0.125 mg／kg， 0.25 mg／kg and 0.5 mg／kg） and vehicle， respectively.In the chronic experiment， twenty-two mice were divided into two groups random ly.Mice were given vehicle or MK-801 （0.25 mg／kg per day） for 14 d.Quantitative real-time PCR technique was then used to detect the relative expression levels ofmiR-181b in the frontal cortex at 15 min after treatment in acute experiment or at 15 min after last injection on 14th day in chronic experiment.Results In the acute MK-801 administration groups， relative expression levels ofmiR-181b were 1.00 ± 0.13 in control group， 0.65 ± 0.05 in 0.125 mg／kg group， 0.61 ± 0.05 in 0.25 mg／kg group， and 0.91 ± 0.08 in 0.5 mg／kg group， respectively. MiR-181b expression levels significantly decreased in MK 0.125 mg／kg and MK 0.25 mg／kg groups while remained unchanged in 0.5 mg／kg group compared to the control group.In the chronic MK-801 administration group， relative expression level of miR-181b significantly increased compared to the control group（1.86 ± 0.19vs.1.00 ± 0.10，P＜ 0.05）.Conclusion There are different effects of acute and chronic administra-tion of MK-801 on miR-181b in the mouse frontal cortex，indicating thatmiR-181b may play different roles in the acute and chronic mousemodels of schizophrenia.

Dizocilpine maleate Frontal cortex MicroRNA-181b qPCR

R749.3

A

10.3969 ／j.issn.1002－0152.2012.06.006

☆ 国家自然科学基金重点项目（编号：30870893）

* 温州医学院基因组医学研究院（温州 325000）

（E-mail：chenxghn＠yahoo.com.cn）

△ 中南大学湘雅二医院精神卫生研究所

2011－11－02 ）

文飞）

·论 著·