王谆

(郑州市第三人民医院普外科，郑州450000)

结肠癌、直肠癌在临床较常见，侵袭和转移是其预后不良的重要因素。claudins家族是构成细胞紧密连接的重要成分之一，其异常表达与肿瘤的侵袭转移相关，目前人们关注最多的是claudin-7［1］。上皮黏附素(E-cadherin)对调节细胞外的黏附有重要作用，近年来相关研究认为其与claudins家族可能具有协同作用［2］。本实验对结肠癌、直肠癌标本进行claudin-7和E-cadherin的流式细胞学检测，探讨其临床价值，以期为临床研究结肠癌、直肠癌的发展及判断预后提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007年6月至2008年12月在我院确诊为结肠癌、直肠癌并进行手术的患者122例为观察组，其中男62例，女60例，年龄36～78(53.3 ±5.4)岁，留取新鲜组织，并于 -80℃冰箱中保存。上述患者均符合WHO关于结肠癌、直肠癌的诊断标准。排除标准:术前放、化疗的患者、临床资料不完整的患者。收集同期经病理证实为正常结肠黏膜组织的患者60例为对照组，其中男30例，女30例，年龄36～79(52.5±5.7)岁，保存方法同上。两组患者在性别、年龄等方面比较差异无统计学意义，具有均衡性。

1.2 方法 claudin-7和E-cadherin蛋白均购自武汉博士德公司。claudin-7和E-cadherin的检测采用流式细胞术。将冻存组织取出，置于75%的乙醇中固定72 h后，将组织放在120目的不锈钢网上，剪碎后轻搓，并用0.9%的氯化钠溶液冲洗。收集混悬液后离心，并制成1×106/mL的单细胞悬液。分别取1 mL加入 claudin-7或 E-cadherin蛋白，室温放置30 min后加入磷酸盐缓冲液10 mL，离心，去上清液，加异硫氰酸荧光素-IgG二抗100 μL，避光放置30 min，加入磷酸盐缓冲液10 mL，离心，弃上清后加磷酸盐缓冲液0.1 mL，过滤后应用流式细胞仪进行检测［3］。采用美国BD公司生产流式细胞仪进行检测，并用系统自带软件进行分析。

1.3 结果判断方法 应用的方法计算出荧光指数表示蛋白的相对含量［3］。荧光指数=(蛋白表达的平均荧光强度-对照样本的平均荧光强度)/(正常对照样本的表达-对照样品的平均荧光强度)

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差)表示，采用t检验;计数资料比较采用χ2检验;相关分析采用Pearson线性相关分析;生存分析应用Kaplan-Meier法，生存曲线的比较采用Log-rank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组claudin-7和E-cadherin的表达 两组claudin-7和E-cadherin比较差异有统计学意义(P＜0.05) (表1)。

表1 两组claudin-7和E-cadherin的表达 (%)

2.2 观察组claudin-7和E-cadherin在不同临床病理特征中的比较 claudin-7和E-cadherin在不同肿瘤直径、Dukes分期、Ki67值及有无淋巴结转移的结肠癌、直肠癌患者中比较差异有统计学意义(表2)。

2.3 两组claudin-7和E-cadherin表达的相关性分析 观察组claudin-7与E-cadherin蛋白的表达呈正相关(r=0.45，P＜0.05);对照组claudin-7与E-cadherin的表达未见明显相关性(r=0.12，P＞0.05)。

2.4 观察组claudin-7和E-cadherin表达的生存分析 以荧光指数≥1.0为阳性，结肠癌、直肠癌claudin-7阳性患者3年生存率为85%(34/40)，claudin-7阴性患者3年生存率为29.23%(24/82)，差异有统计学意义(χ2=8.54，P＜0.05);结肠癌、直肠癌E-cadherin阳性患者3年生存率为83.8%(31/37)，E-cadherin阴性患者3年生存率为31.8%(27/85)，差异有统计学意义(χ2=7.42，P＜0.05)，claudin-7和E-cadherin低表达患者的预后较差。

3 讨论

结肠癌、直肠癌临床常见，肿瘤细胞在转移过程中细胞间的黏附作用降低，细胞连接松散。钙黏附素是一组Ca2+依赖跨膜蛋白，包括至少9个基因家族，主要参与介导钙离子依赖的同型细胞间的黏附，在维持正常组织结构方面发挥着重要作用。也有观点认为E-cadherin是介导同型细胞相互黏附的跨膜糖蛋白［2］。在正常组织中E-cadherin遍布在胚胎组织和上皮细胞中，不仅有调节原始胚胎组织发育的作用，还参与细胞间的物质的交换和信息的交流，同时对保持细胞、组织的完整性有重要价值。在E-cadherin的表达丢失时，引起同质类型细胞黏附性差，并脱离原发灶，具有血行和淋巴道转移的潜能［4］。claudins是构成紧密连接的骨架蛋白，是紧密连接结构与功能的重要组成成分。Claudins家族的NH2-和COOH-端位于细胞内部，C末端可与内层的蛋白(如ZO-1、ZO-2等)分子连接;细胞外的肽链可以形成两个跨膜的环，这两个环可以和邻近的其他细胞的同种类型环相接触而行使功能［5-6］。claudin-7是Claudins多基因家族中的重要成员之一，目前认为claudin-7是潜在的肿瘤抑制剂［7-8］。

本实验结果显示，结肠癌、直肠癌中claudin-7和E-cadherin低表达，提示两者对肿瘤发生有重要作用，即claudin-7和E-cadherin高表达可以抑制肿瘤的发生，反之亦然。实验结果显示 claudin-7和E-cadherin的表达与肿瘤直径、Dukes分期、Ki67值及淋巴结转移有一定关系，由于以上因素均与患者的预后相关，提示claudin-7和E-cadherin的表达可能与预后有一定关联。生存分析直接证实了claudin-7和E-cadherin与预后的相关性。实验结果显示，claudin-7和E-cadherin的表达呈正相关，提示两者具有协同作用。E-cadherin的异常表达可以促进肿瘤的浸润和转移，其异常表达时引起癌细胞从原发灶的癌组织中分离并脱落，同时引起N-cadherin的表达增强，使肿瘤细胞与脉管的内皮细胞或周围的基质成分的黏附性增强，引起转移的发生。因此，Claudin-7蛋白可以成为细胞与细胞间紧密连接成分的重要基础，对细胞的屏障功能和极性的维持有重要价值，此结构可以有效地限制癌细胞的营养供应，进而发挥抑癌作用。当Claudin-7蛋白低表达时，细胞的紧密连接功能损害，细胞与细胞间松散，此时与E-cadherin引起的黏附性下降共同作用，引起肿瘤扩散的发生，同时也可以使肿瘤生长时产生的促肿瘤生长因子随之扩散。E-cadherin还对肿瘤细胞与血管平滑肌细胞或外皮细胞之间的黏附发挥着重要作用，主要表现为促进肿瘤间质的血管形成及肿瘤细胞-间质细胞的迁移，使肿瘤更加富有侵袭性［9］。

综上所述，结肠癌、直肠癌中claudin-7和E-cadherin异常表达，两者在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，术后联合检测claudin-7和E-cadherin的表达对判断结肠癌、直肠癌的预后有重要价值。

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