王安宇，魏良纲，乔艺杰，张 超，张定安，何光志

(1贵阳中医学院第二附属医院，贵阳550002;2贵阳中医学院基础医学院)

类风湿关节炎(RA)是一种主要由T细胞介导，以慢性、复发性多滑膜关节炎为主要表现的系统性、炎症性、自身免疫性疾病［1］。有研究［2］表明，Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)在RA的发病中发挥着主要的作用，被认为是最重要的RA自身抗原之一。理论上，若以适宜浓度的CⅡ诱导人体免疫耐受，就有可能预防RA的发生。Trentham等［3］采用鸡天然CⅡ治疗RA，取得了显著疗效。宋新强等［4］用构建的鸡Ⅱ型胶原基因疫苗治疗大鼠关节炎，其关节炎症状明显改善，更是有力地支持这一观点。目前尚无人Ⅱ型胶原基因疫苗的报道。本研究拟克隆出人Ⅱ型胶原蛋白cDNA(hCⅡcDNA)，为后续的基因真核表达载体即基因疫苗的构建打下基础，为人CⅡ基因疫苗对RA的防治作用及其机制的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂 人关节软骨组织来自贵阳中医学院第二附属医院类风湿科的需做关节切除术(关节置换术)的RA患者(汉族，女性，42岁)。总RNA抽提试剂盒和逆转录试剂盒为GIBCOBRL公司产品;DNA Marker DL10000(5000)、TaqPCR MasterMix、凝胶DNA回收试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品;大肠杆菌DH5α及pMD18-T Vector、PCR引物合成试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 人关节软骨组织总RNA的提取 从－80℃冰箱中取出冷冻关节软骨组织，切取组织约1 g，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取关节软骨组织总RNA。

1.2.2 hCⅡcDNA的扩增 以抽提的总RNA为模板，以Oligo dT(18)为反转录引物，按照Promega逆转录试剂盒说明操作，反应体系:42℃ 60 min，95℃10 min。……