朱 旭 梁永彪 郑利平

南宁市第二人民医院检验科，广西南宁 530031

我国是鼻咽癌的高发国家，其发病率占头颈部肿瘤的首位。已有大量的实验研究表明，EB病毒（Ep.Stein-Barr virus，EBV）与鼻咽癌关联密切，传统的EB病毒相关抗体的检测是诊断及监测患者病情最常用的方法，但是它的敏感性和特异性较差[1]。本研究应用荧光定量PCR技术对鼻咽癌患者血浆EBV-DNA进行检测，旨在探讨EBV-DNA在鼻咽癌诊断方面的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2006年1月～2010年10月在笔者所在医院住院的初诊鼻咽癌患者50例为研究组，其中男33例，女17例；年龄23～72岁，平均（45.0±4.2）岁；病理类型：中分化鳞癌6例，低分化鳞癌44例。所有患者均未进行任何治疗。选择同期住院的头颈部其他癌瘤患者20例作为病例对照组，其中男12例，女8例；年龄26～70岁，平均（46.2±3.9）岁；所有患者均有病理及细胞学诊断依据。以同期健康体检者50例作为健康对照组，男26例，女24例；平均（41.0±4.4）岁。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集 所有对象均抽取3 mL的外周血，加入到EDTA抗凝试管中，离心后分离出2 mL血浆，保持-20℃冻存。

1.2.2 DNA抽提 上述20 mL血浆抽提DNA，EBV基因扩增试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供，仪器为Roche LightCycler型PCR仪（美国），检测方法按说明书进行。

1.2.3 血浆EBV-DNA检测采用荧光定量PCR法 上游引物：5’-CCCAA-CACTCCACCA-CACG-3’，下游引物：5’-TCT-TAGGAGCTGTCCGAGGG-3’，探针序列：5’-CTGTCTGTAAAGTCCAGC-CTCC-（TAMRA）-3’。扩增程序：93℃ 2 min，1个循环→ 93℃ 5 s，57℃ 45 s，40个循环→ 37℃，1 min，1个循环。518 nm为检测波长，阳性定量参考品为 1×107、1×106、1×105、1×104拷贝 /mL的EBV-DNA 的BamHI-W片段阳性模板，小于最低检出限（1×103拷贝/mL）为阴性。

1.2.4 EBV-DNA含量计算公式

C：为血浆中待测DNA的拷贝数（拷贝/mL）；Q：为1次PCR反应后检测到的 DNA拷贝数；VDNA：为抽提得到的DNA液总体积；……