邓宇虹 郑祝剑 邱晓露 徐琨

（1江西省儿童医院 南昌330006；2江西医学院上饶分院 上饶334000；3南昌大学医学院 南昌330006）

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是肺对不同情况下严重损伤时的非特异性反应，其特征是严重的进行性呼吸衰竭，尽管吸入高浓度氧仍不能纠正，是在抢救或治疗的过程中发生以肺微循环障碍为主的小儿急性呼吸窘迫和低氧血综合征。TLR4是一种跨膜蛋白，人类编码的基因定位在9q32-q33，这种蛋白由胞外区、跨膜段和胞内区3部分组成。胞外区主要含十几到二十几个串连的富含亮氨酸重复序列(1eucine rich repeats,LRRs)。LRRs有利于促进蛋白质间的相互粘附，识别病原体或其产物。胞内区由Toll同源结构域(Toll Homology domain，TH domain)和分子羧基端长短不同的短尾肽组成。TH结构域是下游进行信号转导的核心元件，此区域关键位点的突变或序列缺失将阻断信号向下传递。当编码删的基因突变，就会导致其编码蛋白改变，从而使信号传导发生变化，影响一系列反应。ALI／ARDS中病原微生物抗原和内源性抗原等配体被肺内中性粒细胞、内皮细胞等细胞表面的TLR4识别后，早期激活NF-kB和AP-1等转录因子以激活细胞，诱导以中性粒细胞浸润、微血管内皮细胞损伤与蛋白液体渗漏为特征的炎症反应。后期，TLR4介导炎症反应修复，以维持肺泡上皮细胞的修复，促进ALI／ARDS的康复[1]。本研究通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术及基因测序技术检测儿童ARDS患者TLR4等位基因Asp299Gly和Thr399Ile基因型的多态性，分析TLR4基因多态性与儿童ARDS之间是否存在相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 ARDS组儿童急性呼吸窘迫综合征患者为2007年10月～2012年8月就诊于江西省儿童医院PICU和NICU的48例患者，对照组为儿童保健科59名体检者。儿童ARDS患者诊断均符合2006年中华医学会重症医学分会制定的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征诊断和治疗指南。样本提取：每个人均抽3 mL抗凝静脉血，使用蛋白酶/酚/氯仿法提取基因组DNA，－20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 TLR4-Thr399Ile、Asp299Gly基因多态性检测根据GenBank中TLR4受体基因序列（基因号：AH009665）设计引物，引物序列由上海生工公司合成。引物如下：Thr399Ile引物的序列为：A1：5'-GGT TGCTGTTCTCAAAGTGATTTTGGGAGAA-3'；A2: 5'-CCTGAAGACTGGAGAGTAGTTAAATGCT-3'。Asp299Gly引 物 的 序 列 为 ：B1：5'-GATTAGC ATACTTAGACTACTACCTCCATG-3';B2：5'-GAT CAACTTCTG AAAAAGCATTCCCAC-3'。

1.2.2 PCR反应体系 在25 μL反应体系中含有DNA 2.0 μL，10×buffer 2.5 μL，ddH2O 17.5 μL，dNTPs 0.5 μL，1 μmol/L引物各1.5 μL。Tap聚合酶1.0 μL。循环条件：95℃30 s、55℃30 s、72℃30 s，36个循环，最后72℃充分延伸5 min。取5 μL产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 限制性内切酶长度多态性技术（RFLP）分析取检测有目的条带的PCR产物进行酶切。取5 μL PCR反应产物并加入10×buffer 1 μL，针对位点Asp299Gly用限制性内切酶Ncol 1 μL，针对位点Thr399Ile用限制性内切酶Hinf-I 1 μL，在恒温水浴箱37℃水浴20 h。酶切产物和相应的PCR产物在3%琼脂糖凝胶电泳，B紫外透射凝胶成像仪系统观察结果，并用数码摄像机拍摄图像保存。

1.3 统计学处理 常用Hardy-Weinberg平衡规律计算基因型和等位基因频率，所有统计学分析均采用SPSS11.5软件，等位基因频率在组间的差异分析采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR4基因多态性结果 Thr399Ile基因多态性PCR产物可被Hinf-I内切酶解成377 bp和29 bp的两个片段。电泳后仅出现406 bp条带的基因型为Thr/Thr，同时出现377、29 bp条带的基因型为Ile/Ile，同时出现 406、377、29 bp的基因型为Thr/Ile。 Asp299Gly基因多态性 PCR产物可被Nco1内切酶解成223 bp和26 bp的两个片段。电泳后仅出现249 bp条带的基因型为Asp/Asp，同时出现223、26 bp条带的基因型为Gly/Gly，同时出现249、223、26 bp的基因型为Asp/Gly。

2.2 TLR4基 因 Thr399Ile、Asp299Gly与 儿 童ARDS的相关性 儿童ARDS组和对照组Thr399Ile和 Asp299Gly基因型频数分布符合Hardy-Weinberg平衡。TLR4基因Thr399Ile位点差异无统计学意义（P＞0.05），相应等位基因间差异也无统计学意义（P＞0.05）。见表1。Asp299Gly的基因突变率较低，所有样本仅在儿童ARDS组检测到2例，其余均为纯合子。儿童ARDS组与对照组相比，TLR4基因Asp299Gly位点差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 两组TLR4 Thr399Ile的基因型和等位基因频率 例

表2 两组TLR4 Asp299Gly的基因型和等位基因频率 例

3 讨论

病原微生物具有一些保守分子结构，如细胞壁含有的肽聚糖、脂多糖等，这些物质对TLR4具有活化作用，称为病原相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern，PAMPs）。TLR4是识别类脂PAMP的，其作用较为局限，可能主要参与内毒素的识别与信号传导过程[2]。TLR4主要在肺巨噬细胞、腹腔巨噬细胞、枯否细胞、脂肪细胞以及人类胚胎肾细胞、齿龈纤维母细胞及人表皮内皮细胞等[3]分布。TLR4的信号传导途径可以通过髓样分化因子88(myeloiddifferentiation factor 88，MyD88)依赖途径和MyD88非依赖途径。病原微生物抗原和内源性抗原等配体被肺内皮细胞等细胞表面的TLR2、TLR4识别后，通过依赖MyD88或非依赖MyD88信号传导途径激活核转录因子 (NF)-kB，进而诱导肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-l、环氧合酶2、细胞内黏附分子1、胶原酶等多种细胞因子及化学因子的生成与释放，引发以中性粒细胞浸润、微血管内皮细胞损伤与蛋白液体渗漏为特征的炎症反应[4]。Togbe等报道吸入脂多糖诱导的急性肺部炎症和气道上皮损害程度以及肺泡损伤后渗漏的蛋白量与TLR4表达水平呈剂量依赖关系，而不表达TLR4的TLR4基因突变的小鼠(C57BuloscNQ)肺泡蛋白量与正常对照组没有差异[5]。阻断TLR4可抑制内毒素对内皮细胞的激活作用，提示TLR4也可能是内毒素作用于血管内皮细胞的受体途径。TLR4主要识别脂多糖、紫杉醇、HSWoO、HSP70、HSP96、呼吸道合胞病毒融合蛋白、血纤维蛋白原和透明质酸寡糖等[3]。

近年来关于TLR4基因多态性与感染性疾病易感性的相关研究已逐步引起关注，目前对TLR4研究最多的单核苷酸多态性（SNP）是Asp299Gly和Thr399Ile两个位点的突变，位于TLR4转录起始处第三外显子上即编码LRR的区域，一种SNP是位于1 196位的C/T碱基转换，使位于399的苏氨酸变为异亮氨酸，而另一种SNP是位于第896位点的A/G碱性转换，使氨基酸序列第299位置的天门冬氨酸转变为甘氨酸[6]。

本研究我们采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性方法，对48例ARDS患儿和59名健康儿童进行TLR4等位基因Thr399Ile和Asp299Gly的基因型检测。结果发现在ARDS患儿和健康体检者中，TLR4受体基因Thr399Ile、Asp299Gly两位点的基因型之间差异无统计学意义（χ2=0.010，P=0.920；χ2=0.412，P=0.52）。表明感染性 ARDS患者的TLR4基因Asp299Gly和Thr399Ile多态性与儿童ARDS发病无显著相关性，这可能与样本量有关，需要进一步研究。

[1]Jiang D,Liang J,Fan J,et al.ReguIation of lung injury and repair by Toll-Iike receptors and hyaluronan[J].Nat Med,2005,11:1 173-1 179

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[3]Bacher O,Adner M,Uddmam R,et a1.Toll-like receptor stimulation induces airway hyper-responsiveness to bradykinin，an effect mediated by JNK and NF-kappa B signaling pathways[J].Eur J lmmumol,2004,34(4):1 196-1 207

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[5]Togbe D,Schnyder-Candrian S,Schnyder B,et al.TLR4 gene dosage contributes to endotoxin-induced scute respiratory inflammation[J].J Leukoc Biol,2006,80(3):451-457

[6]Arbourn C,Lorenz E.TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans[J].Nat Genet,2000,25(2):187-191