效应面法优化对甲氧基肉桂酸乙酯的包合工艺

2012-01-25刘雪梅李继英苏霞

中成药 2012年5期

刘雪梅，李继英，苏霞

(广西中医学院药学院，广西南宁530001)

沙姜是姜科植物山柰Kaempferia galanga L.的干燥根茎，温中化湿，行气止痛，主治胃寒疼痛、牙痛、风湿关节痛、跌打损伤，药用价值较高［1］。沙姜也是一味常用的壮药(壮药名为Sagieng)，用于治疗咳嗽和肺病、促进伤口愈合，壮族人民早已使用它并积累了丰富的临床经验［2］。除药用外，还大量用作副食和调味剂。

据报道，山柰挥发油抑制胃癌细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，对化疗药物有协同增效作用;而挥发油中的肉桂酸酯类化合物，尤其是主要成分-反式和顺式的对甲氧基肉桂酸乙酯(MEC)有抗促癌活性［3-6］。由于植物药遗传毒性低，因此对甲氧基肉桂酸乙酯有较强的抗肿瘤利用价值，值得进一步深入研究。但是对甲氧基肉桂酸乙酯不溶于水，严重影响了它的生物利用度［7-8］。而β-环糊精不仅能提高药物的溶解度，还能改善药物的生物利用度和稳定性。

国内常用均匀设计或正交设计进行工艺优化和处方筛选，但这两种方法精度不够，预测性不佳，国外很少采用。星点设计和效应面优化法是国外药学工作者常用的实验设计和优化方法，优选条件预测性好;近年来国内时有该法用于药学研究的报道［9-13］。本实验采用饱和水溶液法制备对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物，星点设计-效应面法优化其最佳的制备工艺，为方便对甲氧基肉桂酸乙酯的临床应用提供基础研究。

1 仪器和材料

85-2恒温磁力搅拌器(武汉精华科研仪器公司);Nexus470傅立叶红外拉曼光谱仪(美国Nicolet公司);AE100电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);GC—14A气相色谱仪(日本岛津公司);FW 24A型压片机(天津光学仪器厂);Agilent 8453紫外可见分光光度计(美国安捷伦公司);CAMAG REPROSTAR 3薄层色谱仪(瑞士卡玛公司)。

对甲氧基肉桂酸乙酯(武汉合中化工有限公司，批号:20070802，纯度≥99.0%);对甲基肉桂酸乙酯(批号:0835-9601，购自中国药品生物制品检定所);β-CD(广东省郁南顺中食品贸易有限公司);其余试剂为分析纯，色谱纯。

2 方法和结果

2.1 对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的制备［14］

经过预实验筛选，采用饱和水溶液法制备。在一定温度下，称取一定量的β-CD溶于水中，加热溶解，制成饱和溶液;同时称取一定量的对甲氧基肉桂酸乙酯溶于95%乙醇中。待β-CD饱和溶液稍冷后，用恒压分液漏斗将对甲氧基肉桂酸乙酯乙醇溶液缓慢滴入饱和溶液中，恒温40℃搅拌。继续搅拌一定时间后，停止加热，继续搅拌，降至室温，静置，冷藏24 h，得沉淀，抽滤，洗涤，45℃干燥，称质量，得白色粉末状的对甲氧基肉桂酸乙酯包合物。

2.2 包合率和包合物产率测定气相色谱法测定包合物中对甲氧基肉桂酸乙酯［15］。

2.2.1 色谱条件SE-30石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。柱温200℃，进样口温度与检测器温度为250℃，载气为氮气。

2.2.2 定量测定

2.2.2.1 样品溶液制备精密称取对甲氧基肉桂酸乙酯对照品适量，加入甲醇超声30 min，完全溶解后加甲醇至刻度，摇匀，制成质量浓度为1.0 mg/mL的对照品溶液。精密称取适量包合物置量瓶中，加适量甲醇超声处理，溶解后加至刻度，摇匀制成供试液。

2.2.2.2 标准曲线的制备精密量取对甲氧基肉桂酸乙酯对照品溶液分别配成质量浓度为1.0、0.5、0.25、0.125、0.075 mg/mL的对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各4 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积。以各质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=6×106x－205 745，r=0.999 5，表明对甲氧基肉桂酸乙酯在0.3～4 μg/μL范围内具有良好的线性关系。对该方法进行精密度试验、重复性试验、24 h稳定性测定、加样回收试验，得到对甲氧基肉桂酸乙酯的RSD分别为1.95%、1.36%、2.65%，回收率为101.65%。(n=5)

气相色谱法测定供试液的对甲氧基肉桂酸乙酯，每批3次，计算包合率和包合物产率。

包合率和包合产率的计算公式如下:

2.3 包合物的鉴定

2.3.1 红外光谱法分别测定对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD物理混合物、对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物、对甲氧基肉桂酸乙酯的溴化钾压片、β-CD的溴化钾压片在室温下进行红外光谱，扫描范围为500～4 000 cm－1。结果见图1。由图可知，物理混合物的IR呈现出药物和β-CD的叠加峰型特征。其—OH峰位(3 385.73 cm－1)与药物的—OH峰位(3 387.48 cm－1)一致，C峰位(1 631.29 cm－1)和药物的CO峰位(1 630.10 cm－1)一致，C—H峰位(2 924.92 cm－1)与β-CD的C—H峰位(2 925.86 cm－1)一致;而包合物的IR与物理混合物明显不同，某些特征峰向高波数位移，强度大为减弱，如CO峰位升高(由1 630.10升至1 643.32 cm－1);某些特征峰向低波数位移，强度大为减弱，如—OH峰位降低(从3 387.48降至3 373.62 cm－1)，而包合物与β-CD的IR很相似，如C—H峰位(2 930.25 cm－1)与β-CD的C—H峰位(2 925.86 cm－1)相近，表明了药物与β-CD产生了包合作用;但二者仍存在明显差异。

2.3.2 薄层色谱法分别精密称取适量对甲氧基肉桂酸乙酯、对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物，用无水乙醇定容至2 mL;精密称取包合物适量，加入石油醚，振荡，洗涤，自然挥干醚液，用无水乙醇定容。各取10 μL点于同一硅胶G薄层板，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶0.5∶1.5)为展开剂展开，取出晾干，紫外仪366 nm下检视;再以5%磷钼酸溶液显色，105℃烘干。结果显示366 nm下可见对甲氧基肉桂酸乙酯醇溶液、对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物醇液Rf值基本一致，而对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物醚洗溶液相应位置无斑点，表明对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物已形成，见图2。

2.3.3 紫外分光光度法精密称取适量对甲氧基肉桂酸乙酯原药、β-CD、对甲氧基肉桂酸乙酯+β-CD、对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物(含有对甲氧基肉桂酸乙酯量相当于原药质量)，5 mL无水乙醇溶解后加入蒸馏水定容至100 mL，以溶剂为空白溶液，于紫外分光光度计中在200～400 nm波长范围内扫描。结果对甲氧基肉桂酸乙酯在210、225、309 nm处有最大吸收，β-CD和溶剂在λmax处无吸收干扰。包合物与原药的吸收图谱基本相同，只是吸收强度稍减，表明包合物形成过程为一物理包合过程，未与β-CD发生化学反应，包合物基本形成。紫外吸收光谱见图3。

图1 β-环糊精(a)、对甲氧基肉桂酸乙酯(MEC)(b)、物理混合物(c)、包合物(d)的红外图谱Fig.1 IR spectra of β-CD(a)，MEC(b)，β-CD+MEC mixtures(c)and inclusion complexes(d)

图2 对甲氧基肉桂酸乙酯、对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物薄层色谱图Fig.2 TLC chromatogram of MEC and inclusion complex

2.4 星点实验设计经过预实验考察，确定用药比例(X1)、包合温度(X2)和包合时间(X3)为星点设计实验考察的影响因素，其水平范围为:用药比例为10%～20%，包合温度为30～50℃，包合时间为30～150 min。以对甲氧基肉桂酸乙酯的包合率和包合物产率为考察指标。其中，包合率为工艺筛选的主要指标;在β-CD和对甲氧基肉桂酸乙酯投料量一定的情况下，包合物产率为次要指标。采用三因素五水平星点设计安排实验，实验设计和结果见表1、表2。

图3 对甲氧基肉桂酸乙酯(a)、β-CD(b)、物理混合物(c)、包合物(d)的此外吸收光谱Fig.3 UV absorption spectrum of MEC(a)，β-CD(b)，MEC+β-CD mixtures(c)and MEC-β-CD inclusion complexes(d)

2.5 数据处理与结果分析将表2中对甲氧基肉桂酸乙酯的包合率和包合物产率的数值标准化为0～1间的归一值，通过数学转换得到总评归一值(总评OD值)。以用药比例、包合温度和包合时间为自变量，以各总评归一值对自变量进行多元线性回归和二次多项式拟合，以复相关系数(r)和P＜0.05为模型判定标准，Statistica 6.0软件绘制效应面确定对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的最佳工艺。结果如下:

表1 星点设计因素和水平Tab.1 Factors and levels of central composite design

表2 星点设计实验和结果(n=3)Tab.2 Result of central composite design(n=3)

多元线性拟合方程:y(OD)=－0.799 1+0.004 2X1+0.026 8X2+0.001 9X3，r=0.644 4，F(3，11)=2.603 4，P=0.104 7＞0.05，表明线性拟合不佳，不宜用线性模型。

二项式拟合方程:y(OD)=－12.744 6+0.663 8X1+0.332 2X2+0.032 0X3－0.000 6X1X2+0.000 6×10－2X1X3－0.000 1X2X3－0.021 2X21+0.003 6X22－0.000 2X23，r=0.839 2，相对于线性拟合有大幅提高，但有多项系数值的P值＞0.05，应对方程删项简化，提高其可信度。本实验以该方程作为分析及模型的预测，故未将模型进一步简化。

由于效应面图只能表达含2个自变量的函数，故本实验固定其中1个自变量为中值，另外2个影响因素为自变量，总评OD值为因变量，以拟合的二项式方程为数学模型，绘制效应面图，并从效应面上选取最佳的实验条件。见图4～6。

图4 用药比例和包合温度及其相互作用对总评OD值的影响(包合时间90 min)Fig.4 Correlative effects of proportion of MEC and inclusion temperature(with time of 90min)

图5 用药比例和包合时间及其相互作用对总评OD值的影响(包合温度40℃)Fig.5 Correlative effects of proportion of MEC and inclusion time(with temperature of 40℃)

图6 包合温度和包合时间及其相互作用对总评OD值的影响(用药比例15%)Fig.6 Correlative effects of inclusion temperature and time(with 15%proportion of MEC)

由图4～6可知，总评OD值随着用药比例、包合时间和包合温度的增加，先增加后降低。结合包合物制备的实际情况，确定对甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的较佳工艺为:用药比例为15%，温度为45℃，时间为90 min。经过3次验证实验，实际测得OD平均值为0.972 2，与模型方程理论预测值(0.994 8)的偏差为－2.26%，表明本工艺二项式拟合效果良好，可信度高。