董炳梅，王金良，唐 娜，苗立中，沈志强，

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌（Brucella spp．，Bru）感染引起的一种严重人兽共患传染病，人在接触患病动物或被污染的动物产品后即可发病，世界上每年布鲁氏菌病发病人数超过50万［1］。Bru是一种兼性细胞内感染细菌，菌体表面最主要的抗原是脂多糖（LPS）和外膜蛋白等，其感染的靶细胞主要是巨噬细胞与胎盘滋养层细胞，但也可在树突状细胞（dendritic cell，DC）中生长繁殖。该菌不仅具有抵抗吞噬细胞杀菌作用的能力，并可阻止抗原特异性T细胞对其识别，从而形成有利于其生存和繁殖的微环境，导致慢性持续感染［2－3］。该病主要以Th1型细胞免疫应答为主，由DCs诱导的细胞免疫应答在机体抗Bru感染中发挥着重要作用。本文在分析Bru主要抗原分子生物学特性的基础上，就Bru的致病机制及巨噬细胞与DCs参与的机体抗Bru过程的研究进展作一综述。

1 布鲁氏菌主要抗原的分子生物学特性

Bru的细胞膜结构可分为3层，从内层到外层依次为细胞质膜、外周胞质膜与外膜。外膜与肽聚糖（peptidoglycan，PG）层紧密结合组成细胞壁，含有LPS、蛋白质和磷脂层［4］。Bru 细胞膜中含有的LPS和外膜蛋白等，与细菌的毒力及免疫原性密切相关。近年来随着研究的深入，越来越多的相关抗原及其作用机制被发现证明，在此仅对Bru引起免疫应答的主要抗原做一简要介绍。

1．1 脂多糖 LPS是革兰氏阴性菌的主要表面成分，被认为是炎症应答与免疫调节的激活剂，目前革兰氏阴性菌的脂多糖几乎与内毒素一词成为同义词。但是与大肠杆菌等肠道菌群具有的经典LPS有所不同，Bru LPS诱导的人类单核细胞仅释放了少量TNF－α与IL－1β。确定LPS作为Bru的毒力因子有以下两个依据：第一，Bru的LPS比肠杆菌科的LPS免疫原性小，因此非化脓性Bru LPS不能明显激活补体替代激活途径，对B细胞是一个刺激较小的有丝分裂原，要引起动物致死和诱导产生干扰素，需要的Bru LPS的量是肠杆菌科内毒素量的10倍，因此推测由Bru LPS刺激宿主产生的较小的生物反应，或许是这些病原体在吞噬细胞内存活的一个重要原因。第二，LPS缺陷Bru突变株对补体和多粘菌素B介导的溶菌作用是敏感的。目前，公认光滑型LPS在Bru进入吞噬体的早期表现出重要的作用。最近的研究还表明，Bru2308株的光滑型LPS还潜在地具有维持细菌在宿主巨噬细胞中长期生存的免疫调节活性。

1．2 外膜蛋白 革兰氏阴性菌的外膜蛋白被证明能够调节吞噬细胞的功能，能够激活细胞活素的产生。Bru主要的外膜蛋白在20世纪80年代首次被鉴定具有免疫原性和抗原保护作用［5］。Bru外膜蛋白分组首先由Verstreate等在1982年提出，即将去污剂连续处理抽提法提取的外膜蛋白经SDSPAGE后分为3组：第一组分子量范围88kD～94 kD，多数菌在94kD出现一条带，但有的出现在88 kD，此组蛋白有热稳定性。研究表明，第二组蛋白质其分子量范围在35kD～40kD。第三组蛋白分子量范围在25kD～34kD之间，此组蛋白表现为异质性，SDS－PAGE迁移率有所不同。Santos等对牛种、绵羊附睾种、犬种、羊种Bru粗糙型菌株外膜蛋白经SDS－PAGE后分为两类：一种是粗糙型牛种、绵羊附睾种和犬种Bru，与光滑型牛种Bru一致含有三组主要蛋白质；另一种是粗糙型羊种Bru，在第一组和第二组蛋白质之间多了一条分子量为48kD的带。Afzal发现绵羊附睾种的第二组蛋白有54kD蛋白质，因此第二组蛋白在数量上是多变的，这可能是由于提取方法不同、菌株变异或不同培养条件等原因造成的。

随着分子生物学技术的快速发展，大量研究表明，Bru的外膜蛋白有很强的免疫原性，可能与Bru在巨噬细胞内存活有关。目前，分子生物学上研究的Bru主要外膜蛋白有7种［6］，即10kD，16．5kD，19kD，25kD～30kD，31kD～34kD，36kD～38 kD和89kD～94kD。除这些主要外膜蛋白外，已鉴定出的Bru胞蛋白、外周蛋白及一些膜蛋白中也有许多蛋白质具有免疫原性。它们除能够引起宿主体液反应外，更多的是与Bru在巨噬细胞内存活和抗巨噬细胞杀伤能力有关。

1．3 VirBⅣ型分泌系统 编码BruⅣ 型分泌系统的操纵子VirB是一种膜相关转运体（membraneassociated transporter），可以释放底物分子靶向宿主细胞。Ⅳ 型分泌系统对于Bru抵抗宿主细胞内环境的改变是至关重要的，pH值的改变以及宿主细胞营养物质的减少都会诱导Bru VirB操纵子的表达［7］。研究表明，Bru VirBⅣ 型分泌系统不仅可促进机体Th1细胞免疫应答的产生，而且更加能够促进Th2体液免疫应答的产生，并加快IgM与IgG的分泌与循环。羊种、猪种、牛种Bru拥有由12种VirB操纵子成分编码的Ⅳ型分泌系统，能有效地防止吞噬了Bru的吞噬小体与溶酶体的融合，从而阻止Bru被消化，使其能在吞噬细胞中寄生［6］。而且VirB与细菌N型分泌系统同源，该系统分泌的效应分子决定了Bru进入内质网复制相关区。研究表明，VirB1为 Ⅳ 型分泌系统非必需成分，可溶解糖基转移酶位点，从而使 Ⅳ 型分泌系统更易装配与集合；VirB1、VirB9与VirB1l的蛋白亲和力十分相近，且VirB1具有与VirB9同源性很高的C末端，说明在 Ⅳ 型分泌系统形成过程中，VirB1对其它VirB蛋白的产生具有重要影响。VirB2和VirB5蛋白可能是细菌表面菌毛结构蛋白。VirB5和VirB8可引发吞噬细胞产生酸性吞噬空泡，主要调节Bru的吞噬作用和细胞内的运输。VirB8在 Ⅳ 型分泌系统中起主要作用，主要是与VirB9和VirB10在细胞膜上形成群体。VirB3、VirB6、VirB7和VirB10蛋白是细菌跨膜蛋白的传送信号。VirB4有一个完整的 ATP结合区，和VirB11蛋白与VirD4蛋白偶联使ATP酶从表面跨膜进入细胞质。VirB12可作为一种Bru血清学检测标记抗原。VirB操纵子可阻止感染了Bru的DCs的成熟，削弱其抗原提呈能力，从而抑制DCs诱导的Th1细胞免疫应答。

2 布鲁氏菌致病机制研究进展

Bru是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌，主要以巨噬细胞与胎盘滋养层细胞为宿主细胞。然而研究表明，Bru在两种宿主细胞中的生存却依赖截然不同的subsets of genes的产生。在自然宿主、人类、以及试验动物感染中，由于巨噬细胞表达更多的Bru模式识别受体，所以Bru优先感染巨噬细胞［8］。虽然特异性IgG和巨噬细胞INF－γ的活化促进了巨噬细胞的杀伤能力，但是强毒菌株仍能抵抗细胞杀伤作用，甚至在细胞内大量繁殖，削弱巨噬细胞吞噬功能，使巨噬细胞的细胞杀伤作用与抗原提呈功能部分丧失，从而逃避宿主的免疫防御机制，造成持续感染。

2．1 布鲁氏菌侵染巨噬细胞作用机制 Bru经常规吞噬途径侵入巨噬细胞后，在最初的4h内，80%～90%的细菌被杀死，得以存活的Bru首先定居于酸性环境并立即与早期内吞小体融合，但却能抑制与晚期内吞小体和溶酶体融合，随后Bru被转运至复制吞噬体中（replicative phagosome），复制吞噬体的内环境更有利于布鲁氏菌的生存与复制；对复制吞噬体的膜成分的研究表明，含有Bru的空泡在不断地与巨噬细胞内质网相互作用，表明Bru开始自身复制增殖［9］。当Bru在巨噬细胞的复制吞噬体中由对数生长期发展到稳定阶段时，环境会发生改变，其中包括pH值改变、ROIs的作用。此时Bru需要产生对环境改变的持续的抵抗，HF－Ⅰ是一个RNA编码的蛋白质，在多种细菌复制的稳定阶段，对细菌的基因表达发挥了至关重要的作用。另一方面它能促进CydAB的表达与活化，从而保护细菌免遭氧化。另有报道显示，在 THP－1细胞系中，Bru也可在非酸性吞噬小体中生存，可能是Bru抵抗吞噬小体的酸化，从而导致脱酸作用的结果。另有研究显示，Bru可通过抑制IFN－γ调节的相关STAT1蛋白与CBP／P300反式作用子的相互作用，从而逃避IFN－γ活化的巨噬细胞杀菌作用。

Bru光滑型LPS可保护细菌免遭补体调节的细胞杀伤作用。在早期阶段，Bru通过LPS与巨噬细胞膜表面的脂筏相互作用，从而侵入宿主细胞激活机体的初始免疫应答；随后，LPS抑制含有Bru的吞噬小体进一步与溶酶体融合，从而避免被降解。最新研究表明，光滑型LPS对Bru在巨噬细胞中的长期生存具有免疫调节作用，一方面它可以与巨噬细胞表面的 MHCⅡ 结合，形成 MHCⅡ－LPS复合物，此复合物可干扰巨噬细胞以 MHCⅡ 的方式提呈抗原，从而削弱巨噬细胞活化抗原特异性CD4＋T细胞；另一方面，它可以阻止感染了Bru的巨噬细胞的凋亡，从而促进其在宿主细胞中的生存与复制。但是巨噬细胞体外感染粗糙型Bru后，经半胱天冬酶－2与NF－κB调节，极大的促进了巨噬细胞的程序性死亡，并伴随着TNF－α及IL－1β等细胞因子的释放［10］。Bru外膜蛋白与脂蛋白是诱导机体产生抗Bru免疫应答的重要因素，研究表明，热杀死的Bru脂蛋白Omp16与Omp19与单核细胞／巨噬细胞TLR2作用，可激活细胞释放IFN－α、IL－6、IL－10与IL－12等促炎因子，并且脂蛋白 Omp19可下调IFN－γ的释放，进而抑制人类单核细胞的抗原提呈功能［11］。

2．2 布鲁氏菌侵染胎盘滋养层细胞作用机制 胎盘滋养层细胞可通过其表面热休克蛋白70与Bru结合，从而启动内吞途径，而且胎盘滋养层细胞表面IFN－γ受体的表达，也可促进其对Bru的吞噬。怀孕晚期Bru在胎盘滋养层细胞中生长繁殖，细菌大量快速的复制可以破坏胎盘的完整性或感染胎儿，最终导致流产或产下弱仔、带菌胎儿。目前对感染了Bru的胎盘滋养层细胞中的环境变化知之甚少，反刍动物胎盘滋养层细胞感染Bru后可产生大量的赤藻糖醇，此物质可刺激细菌在细胞中的生长繁殖。

2．3 树突状细胞与布鲁氏菌相互作用机制 DCs是目前所知道的功能最强、能激活初始性T细胞的专职APCs。它不仅可以通过MHCⅠ、MHCⅡ 类途径提呈抗原，而且还拥有提呈脂类抗原的CD1分子。DCs摄取抗原主要有两条途径，一为巨吞饮作用，即细胞骨架依赖型的、由膜皱折和囊泡形成的液相内吞作用；第二条是由甘露糖受体、TLR等受体介导的内吞途径。

DCs主要表达 TLR2、TLR3和 TLR4，其中TLR2与TLR4已被证明主要识别菌类抗原。研究表明，APCs对G＋／G－菌、结核分枝杆菌、螺旋菌与支原体表面的脂磷壁酸、肽聚糖与LPS等抗原的识别需要TLR2进行信号传导［12］，而 TLR4不能识别革兰氏阳性菌及其抗原，但已被公认为是LPS的主要信号传导受体。被CD14与TLR转染后的CHO细胞系可经TLR2与TLR4识别Brucella abortus，但LPS与类脂质A只能通过TLR4识别，且从光滑型Bru分离的类脂质A更能引起DCs的成熟［13］。对热杀死的Brucella abortus，TLR2可促进机体分泌TNF，但不依赖于TLR4。体内外实验表明，Bru Btp1蛋白与DCs TLR2受体作用，可抑制 DCs的成熟［14］。Sebgupta Dola发现 Bruspp．基因组编码的TcpB蛋白与Toll／IL－1有很高的同源性，它的表达可致磷酸纤维素的降解，阻止MyD88－adapter－like（MAL）信号的形成，有助于Bru逃避天然免疫系统的识别［15］。另有研究表明，Bru通过结合一个长链脂肪酸渣C28而改变LPS的结构，从而逃避与宿主细胞TLR4受体结合。由于Bru鞭毛素蛋白某个区域缺失，因此与TLR5结合的能力较弱。DCs与巨噬细胞膜表面含有大量的甘露糖受体，据研究，位于结核分枝杆菌细胞壁上的 ManLAM（mannose－capped lipoarabinomannan）结合到甘露糖受体上，可限制吞噬小体与溶酶体融合，从而得以在巨噬细胞中生存，造成持续感染［16］。兔热杆菌在血浆调理素缺乏的情况下，可竞争性的抑制甘露糖受体与甘露聚糖的活化，从而降低肺胶原凝集素表面活化剂蛋白A的调理作用，构成有利于兔热杆菌生存的胞内微环境［17］。研究表明，高浓度甘露糖结合凝集素可竞争性的结合于单核DCs，从而抑制Bru LPS诱导单核DCs的成熟与TNF－α等细胞因子的释放［18］。虽然 VirB操纵子在Bru感染巨噬细胞过程中发挥着重要作用，但是对DCs的成熟与DCs诱导的Th1细胞免疫应答没有作用。Bru侵入DCs后，可依赖其外膜蛋白Omp25抑制TNF－α的分泌，从而进一步抑制感染了Bru的DCs的成熟与提呈抗原给初始性T细胞的功能，并且可抑制IL－12的分泌［19－20］。另有研究证明，Bru脂蛋白Omp19能够促进DCs的成熟与T细胞向Th1免疫应答的发展［21］。因此，在Bru感染过程中，DCs的活化在刺激与调节T细胞分泌IFN－γ方面发挥了重要作用。

2．4 巨噬细胞、树突状细胞与布鲁氏菌相互作用机制 巨噬细胞是Bru的主要靶细胞，Bru侵入巨噬细胞后可通过抑制TNF－α的分泌而抑制巨噬细胞凋亡，从而可在细胞内生存并大量繁殖，削弱巨噬细胞吞噬功能，使巨噬细胞的杀伤作用与抗原提呈功能部分丧失，最终逃避宿主的免疫监视；另一方面，巨噬细胞激活初始T细胞的能力较弱，也不表达有抗原提呈功能的CD1分子，故不能有效提呈脂类抗原给NKT细胞；这可能是导致Bru持续感染形成的原因。而DCs是目前所知功能最强大、且能激活初始性T（naïve T cell）细胞的专职抗原提呈细胞。DCs的抗原提呈是一个动态过程［22］。非淋巴样组织内定居的未成熟DCs，具有强大的抗原摄取功能，是机体进行免疫防御的前哨细胞。因此在Bru感染过程中，巨噬细胞与DCs的相互作用机制成为了近期研究的热点。

DCs是连接天然免疫应答与适应性免疫应答的桥梁，研究表明，热杀死的Brucella abortus作用于DCs与巨噬细胞TLR9受体，一方面刺激DCs分泌IL－12p40，诱导IFN－α与IFN－γ等细胞因子的释放，从而促进Th1细胞免疫应答。另一方面，Bru活化的巨噬细胞可提高 NK细胞的杀菌活性［23］。脂蛋白Omp16与巨噬细胞／DCs TLR4受体结合，从而刺激机体产生抗Bru特异性Th1样细胞免疫应答，而且该蛋白被证明是第一个不需要佐剂便可启动抗Bru免疫应答的蛋白［24］。外膜蛋白Omp25可刺激巨噬细胞与DCs释放等量的TNF－α。机体感染Bru后，MyD88对于DCs的成熟及TNF－α、IL－12的分泌有重要作用，而且IL－12的产生依赖于TLR2受体，但是对于巨噬细胞，IL－12的分泌却与TLR2、TLR4受体无关，TLR9基因敲除小鼠感染Bru后，体内含菌量明显高于正常小鼠，证明TLR9对于清除Bru有重要作用［25］。据报道，在体外培养体系中，DCs对 Brucella suis、Brucella abortus与Brucella melitensis表现出更大的易感性［19］，但我们的研究发现，巨噬细胞对Brucella suis的吞噬能力要明显强于DCs，巨噬细胞体外负载Bru12h后出现类似于坏死性凋亡的现象，而DCs却始终保持形态结构的完整。Cristel Archambaud等研究发现，鼻内接种Brucella abortus后，Brucella abortus优先感染肺泡巨噬细胞，肺泡巨噬细胞的清除促进了DCs向引流淋巴结的迁移［26］。然而与肺脏接种Bru结果不同的是，本课题组在证明阴道DCs具有提呈Bru抗原能力的基础上，发现阴道巨噬细胞的清除，不仅没有使DCs表现更多的迁移，相反，却出现了DCs不向引流淋巴结迁移的现象，表明在Bru感染过程中，DCs捕获Bru并向淋巴结迁移的过程具有巨噬细胞依赖性，同时巨噬细胞的清除降低了机体抗Bru的Th1型细胞免疫应答水平［27］。

3 小 结

Bru含有不同的毒力因子，可降低抗原提呈细胞的吞噬能力与抗原提呈能力，延缓细胞成熟，抑制细胞凋亡，减少相关细胞因子的释放。Bru通过改造细胞内环境，从而得以在抗原提呈细胞（巨噬细胞与DCs）中生长繁殖。机体对抗Bru主要以细胞免疫应答为主，主要包括巨噬细胞、DCs等抗原提呈细胞及CD4＋与CD8＋T细胞的活化，其他细胞如NK细胞、Vγ9Vδ2T细胞等也可促进细胞免疫应答。Bru感染初期主要以Th1细胞免疫应答为主，该反应对于清除Bru是至关重要的，但Bru可通过扰乱天然免疫系统的作用从而不同程度的破坏Th1细胞免疫应答及T细胞的作用。Bru诱导的Th1免疫应答可引起IFN－γ与IL－2等因子的释放，IFN－γ可激活巨噬细胞强大的杀菌作用，刺激CD8＋T细胞产生细胞毒作用以及诱导感染了Bru的巨噬细胞凋亡，而且IFN－γ与IL－2促进了巨噬细胞与DCs的抗原提呈及共刺激分子的表达。作为Bru的宿主细胞，DCs与巨噬细胞在抗原提呈及诱导机体免疫应答方面具有重要作用，但是由于不同种Bru的免疫原性的不同，其与相关宿主的关系及诱导的机体的免疫应答还有待进一步研究。

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