孙国庆，哈 福，苗永旺，李大林

（1.云南农业大学动物科学与技术学院，云南 昆明 650201；2.云南省家畜改良工作站，云南 昆明 650225）

溶菌酶全称为1，4－O－溶菌酶，又称N－乙酰基胞壁酸水解酶，是一种碱性水解酶，存在于微生物和多种动、植物的组织及体液中。它可以裂解细菌细胞壁 N－乙酰胞壁酸和 N－乙酰葡糖胺之间的β－（1，4）－糖苷键，具有抗菌、抗肿瘤、抑制血管生成等活性。碱和氧化剂对其有抑制作用，食盐则对其有活化作用。

奶牛乳房炎是奶牛业中危害大、可导致严重经济损失的常见疾病之一，目前此种疾病已成为奶牛养殖业发展的瓶颈。全世界约有2.2亿多头奶牛，其中10%～30%患有各种类型的乳房炎，中国奶牛乳房炎发病率普遍高于国外。近几十年来，由于滥用抗生素，菌株耐药性越来越强，传统的乳房炎抗生素疗法的弊端已日益明显，由此乳房炎抗性基因的研究逐渐成为热点，溶菌酶基因就是其中的重要候选基因之一。

1 溶菌酶的发现及分类

1921年，Alexander Fleming（1881～1955）发现了一种惊人的溶菌物质，后来称之为溶菌酶（lysozyme，LYZ）。由于当时人们未发现其对许多人类致病菌并有杀菌作用，所以一开始并未被重视。90多年后的今天，溶菌酶不仅作为一种模式系统广泛应用于蛋白质化学、酶学、晶体学和分子生物学，而且其溶菌功能已为世人普遍接受并被广泛应用于食品工业和药物制剂。溶菌酶生物学功能的很多方面还没完全搞清楚，比如溶解肽聚糖所得的片段在细菌－宿主相互作用中发挥的作用、存在于同一宿主中的各种溶菌酶之间的生物学关联性等［1］。

1937年，Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出溶菌酶晶体，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。1984年，Jolles等在蛋白质水平上对不同来源的人溶菌酶（human LYZ，hLYZ）进行了研究，并率先发表了hLYZ氨基酸序列。1988年Castanon等从人组织细胞系（U－937）和胎盘文库中筛选出hLYZ cDNA，并对其进行了系统的描述。同年，Yoshimura等用免疫学方法从胎盘λgt11文库中筛选到hLYZ cDNA，并在酵母中表达成功。然后，Chung等和Huang等分别从人的巨噬细胞、帕内特细胞和中国人胎盘中克隆出hLYZ cDNA［2］。2001年，Strausberg等直接向GenBank提交了从人结肠腺瘤中克隆的hLYZ cDNA。

溶菌酶按其来源与氨基酸序列的差异可分为6类：c型（chicken or conventional type，鸡蛋清）溶菌酶，包括来自于胃的溶菌酶和结合钙离子的溶菌酶；g型（goose－type，鹅）溶菌酶；细菌溶菌酶；i型（in－vertebrate type，无脊椎动物）溶菌酶；植物溶菌酶和噬菌体溶菌酶。目前，动物界中发现三类溶菌酶，即c型、g型和i型。i型溶菌酶是溶菌酶家族的一个较新的成员，最初在海星（Asterias rubens）中发现，近年来被广泛研究。对各类溶菌酶的系统发育分析得出，c型溶菌酶主要存在于脊索动物门，节肢动物门的一些纲中也以c型溶菌酶为主，在一些脊索动物和双壳贝类软体动物（无脊椎动物）中发现了g型溶菌酶（至少是与其相关的基因）的存在。

一般来说，较高等的动物都有i型溶菌酶的产生。鸡蛋清溶菌酶是唯一同时存在于脊椎动物、原索动物和无脊椎动物中的类型，也是目前研究得最广泛、最透彻的类型。尽管这三类溶菌酶典型的一级结构同源性并不高，但是它们的三级结构却有着惊人的相似。溶菌酶在抗菌防御方面的生物功能已普遍被人们所接受，此外，有些溶菌酶（不止在一类溶菌酶中）还可发挥消化酶的作用［1］。

牛LYZ基因主要在乳腺中表达，特别是在奶牛患乳房炎的时期，LYZ基因的表达量明显增加，这可能是生物自身的一种防御机制。溶菌酶能够水解微生物细胞壁的N－乙酰葡萄糖胺（NAG）和N－乙酰胞壁质酸（NAM）间的β－1，4糖苷键，肽聚糖的空间结构被破坏，细胞壁破裂。溶菌酶不但对革兰氏阳性细菌具有直接的溶菌作用，而且还在相应辅助因子（分泌型免疫球蛋白A和补体）的参与下，对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）和真菌具有间接的溶解作用。另外，溶菌酶还能与各种诱发炎症的酸性物质结合使其灭活，并能够增强抗菌素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的。

2 溶菌酶的基因结构及其进化

1965年，Phillips等人用x射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构，确认溶菌酶分子近椭圆形，大小为4.5nm×3.0nm×3.0nm，α螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的β片层结构。溶菌酶内部几乎均为非极性，疏水作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用，分子表面有一个容纳多糖底物的裂隙，是溶菌酶的活性部位。

不同物种LYZ基因都由4个外显子和3个内含子构成。外显子2编码酶催化中心的残基（Glu－35和Asp－52）；外显子3编码连接外显子2区域的框架，确定底物位置，完善活性位点，提高催化效率；外显子1和4编码溶菌酶前体信号肽及N端和C端［3］。最先被测序的哺乳动物溶菌酶基因是人类溶菌酶基因，该基因位于人类第12条染色体上，总长5 856bp，内含子和第4外显子中都存在重复序列，与鸡溶菌酶基因的主要差别集中在内含子和3＇非编码区［4］。牛的LYZ基因位于5号染色体，全长5 673bp，5′－UTR长度为31bp，3′－UTR长度为489 bp，由4个外显子和3个内含子组成，编码区核苷酸序列全长为444bp，编码148个氨基酸；四个外显子对应的编码区大小分别为136bp、165bp、76bp和67bp［5］。1979年Baldacci等用分子克隆的方法获得鸡溶菌酶基因，全长约3.9kb，是其mRNA长度的6倍。在牛中最先发现了多基因编码溶菌酶的现象，从此反刍动物溶菌酶及其基因作为一种重要的模式系统在DNA复制、基因重组、遗传进化等研究领域被广泛关注［6］。

C型溶菌酶可分为钙结合溶菌酶和非钙结合溶菌酶两类。非钙结合溶菌酶在一些鸟类和哺乳类中有发现，进化上与α乳清蛋白关系较近，两者氨基酸序列相似性约有40%，都拥有保守的二硫键和一段相似的内含子－外显子结构，它们的二级和三级结构也都相同。但表达部位和功能差别显著。

与广泛存在于动物各种体液中的溶菌酶相比，α乳清蛋白只存在于哺乳动物的乳汁和初乳中。另外，α乳清蛋白也没有催化活性，但是它能改变半乳糖转移酶的特异性，其与半乳糖转移酶的相互作用可以促进乳糖合成。有人认为，哺乳动物中溶菌酶和α乳清蛋白共存的进化因素是共同祖先基因的重复突变及随后的遗传分化［7］。一般来说，α乳清蛋白不具备溶菌酶的活性，溶菌酶也不参与乳糖的合成，但是已有人在针鼹乳中发现了一种蛋白，它同时具备了α乳清蛋白（很弱）和溶菌酶的特性［8］。这一发现有力地支持了溶菌酶和α乳清蛋白来自于同一祖先的假设。

溶菌酶在动物界普遍存在，不同溶菌酶也可同时发现于某一类物种中（例如，脊椎动物中的c型和g型溶菌酶，节肢动物中的c型和i型溶菌酶，软体动物中的g型和i型溶菌酶），由此事实可自然联想到三种溶菌酶的进化关系。不同类型的动物溶菌酶在结构上的一致性也揭示它们有可能来自于同一前体，但是其氨基酸序列的巨大差异又使这一猜测充满了不确定性［1］。

3 溶菌酶基因的多态性研究

陈仁金等利用PCR－SSCP技术对30个公牛家系的610头中国荷斯坦牛LYZ基因进行多态性检测，利用最小二乘均数法对LYZ基因的多态位点与体细胞评分（somatic cell score，SCS）和305d产奶量进行相关分析［9］。根据PCR产物的测序结果与GenBank公布的牛的LYZ基因（GenBank登录号：NC－007303）序列比对表明，在LYZ基因的外显子1的115位点发生T＞G的核苷酸替换，此替换使编码蛋白质的相应氨基酸由Arg变为Leu；该位点经PCR－SSCP法检测发现了3种基因型TT、TG和GG。研究表明，115T＞G位点的GG基因型对中国荷斯坦牛的SCS和305d产奶量有较大的遗传效应，可作为分子标记用于奶牛乳房炎抗性的筛选［9］。Sahoo等通过对印度河流型水牛的研究发现，在LYZ基因外显子3上存在多态位点，并阐明了其与LYZ活性和体细胞数（somatic cell count，SCC）的关联性［10］。孙怀昌等人研究结果表明，表达人溶菌酶基因的重组质粒对奶牛乳房炎具有可靠、持久的治疗效果，可以代替抗菌素使用［11］。

陈仁金等对牛亚科6个群体溶菌酶基因的编码区核苷酸序列进行PCR扩增和测序，结合GenBank上海福特牛该基因（GenBank登录号：NC＿007303）编码区核苷酸序列进行了遗传和进化分析。结果表明，在检测的样本中（水牛除外），有5个核苷酸多态位点，定义了9种单倍型；群内核苷酸多样性（Pi）在0.00000～0.00196之间，揭示群体内遗传多样性较低。构建的分子系统发育树表明，瘤牛、蒙古牛和鲁西黄牛间关系密切，瘤牛和普通牛与牦牛关系相对较近，而与大额牛关系相对较远，为牛亚科的系统进化研究提供了一定理论基础［12］。李锐等用PCR的方法扩增并测定了大额牛LYZ基因的编码区核苷酸序列（444bp），其中 AT含量（53.95%）明显高于GC含量（46.05%），并与GenBank上8个物种相应基因编码区核苷酸序列进行比对分析和系统发育分析，发现大额牛与普通牛（核苷酸序列一致性为99.3%）首先聚为一类，再与其他物种（与人、猪、家鼠、沟鼠、猊猴、鸡和斑马鱼核苷酸序列一致性为76.6%、79.4%、81.8%、71.3%、68.2%、58.9% 和50.5%）聚为一类。该系统聚类结果与动物学分类基本一致，亦与攀宝良利用乳蛋白基因构建反刍动物种系发生树结果［13］基本一致，表明LYZ基因适合构建不同物种间系统进化树［14］。

侯其瑞等对京海黄鸡的LYZ基因的SNPs与生长、产蛋性能和体重的关联分析得出，LYZ基因可能是控制京海黄鸡生长发育的主基因或与主基因紧密连锁，暗示在选种、育种过程中，可将鸡LYZ基因作为京海黄鸡体重候选基因应用于遗传标记辅助选择［15－16］。许罕华等在编码细菌氯霉素乙酰基转移酶的融合基因序列中插入鸡LYZ基因3＇端核基质附着区（MAR）表达试验结果表明，鸡LYZ基因3＇端MAR在同源细胞系对基因表达没有激活作用，与该基因5＇端MAR在同源或异源细胞系中能激活基因表达形成鲜明对照，表明5＇端MAR和3＇端 MAR在调节鸡LYZ基因表达上存在一种协调关系。人溶菌酶突变可导致遗传性非神经系统淀粉样病变症（h ereditary systemic amylo idosis），由溶菌酶氨基酸序列中Phe57Ile、Trp64Arg、Ile56Thr和 Asp67His改变引起［17－18］，该病患者组织中有大量的淀粉样物质沉淀，临床表现伴随肾脏、心脏和肝脏的病变。

4 溶菌酶及其基因的应用前景

溶菌酶具有多种药理作用，现在已经广泛应用于医学临床。作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效。溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，用溶菌酶处理G＋细菌可以在破坏细胞壁后得到原生质体，所以被广泛用于生物技术中，成为基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。溶菌酶作为一种非特异性免疫因子，对肠道中腐败性微生物有特殊杀灭作用，溶菌酶是双歧杆菌增长因子，有防止肠炎和变态反应的作用，对婴、幼儿的肠道菌群有平衡作用。有试验表明，在低度酒中每公斤添加20mg的溶菌酶替代水杨酸作防腐剂，对酒的风味无不良影响，且受酒类澄清剂的影响很小，并可以去除水杨酸的毒性，是低度酒类较好的防腐剂。日本成功把溶菌酶用于清酒的防腐剂。最近的研究表明，水牛奶中的溶菌酶与欧洲牛（bovine）的有56.5%同源性，与马的有30.4%同源性。水牛溶菌酶的特异活性是普通牛的10倍，并且具有更加广的pH耐受范围。该酶主要对革兰氏阳性菌有效。据奶水牛产地当地人称，食用水牛奶不易生病，具有良好的增强免疫力功效。

虽然溶菌酶广泛存在于动植物体内，但天然含量少，提取纯化过程步骤繁琐，产量低，无法大量获取，若采用化学合成方法成本昂贵，大多数普通患者无法承受。与此相比，若采用基因工程的方法来合成溶菌酶，它具有操作简单，成本比较廉价，能大量获取，重复性好，有广阔的市场应用前景。牛乳溶菌酶作为c型溶菌酶中的一种，在治疗奶牛子宫内膜炎、乳房炎等细菌性疾病中不仅具有相似的生物学作用，还具有同源性的优势。付世新等通过毕赤酵母GS115分泌表达系统获得了重组牛乳溶菌酶，为溶菌酶的规模化生产奠定了基础［19］。

对LYZ基因的研究多集中在转基因和疾病防治上，而对牛的LYZ基因其在机体中的生物功能和作用途径还有很多尚待探索的地方。而目前对牛的LYZ基因多态性与奶牛乳房炎关联分析的研究较少。刘梅等认为未来的研究重点已经不是溶菌酶的杀菌作用，而是其消化功能和其他未知的生物学功能［20］。研究发现，反刍动物的皱胃、食叶鸟的嗉囊、文昌鱼肠和一些昆虫（如果蝇、工蚁、臭虫和蚊子等）消化道的不同部位以及唾液腺中，溶菌酶c的含量丰富，推测可能与溶菌酶c的消化功能相适应［20］。Lee－Huang等研究发现，人溶菌酶作为人绒毛膜促性腺激素的组分之一，其107～115位的9个氨基酸（RAWVAWRNR）能有效抑制HIV病毒的复制，并能调节HIV感染细胞的基因表达，具有抗HIV病毒的作用［21］。此外，在工业上，溶菌酶可以作为食品的保鲜剂或添加剂。例如，在婴儿食品中添加溶菌酶可以使其更接近人乳的成分。同时，溶菌酶能够增强抗生素的作用效力，增加机体的抗感染能力。随着溶菌酶功能的不断发现，在未来的工业、医学和其他领域中，溶菌酶必将具有重要的应用价值。已有人尝试利用LYZ基因来研究生物的进化，并得到与传统的形态学方法、生化方法等基本一致的结果，表明LYZ基因可能对生物进化研究有帮助。

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