杨蕙王宇红张秀丽韩远山丁志平

［1.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南长沙410007；2.湖南中医药大学第一附属医院中药药理（心血管）实验室，湖南长沙410007；3.湖南中医药大学，湖南长沙410007；4.湖南省中医药研究院，湖南长沙，410007］

马钱子粉属于常用的有毒中药，临床主要用于治疗各种难治性疾病，由于疗效确切，力猛效捷，为历代医家所推崇。前期工作研究表明，马钱子微粉化后由于比表面积增加，所含药效成分的释放速度与释放量远优于中药普通粉体与传统中药饮片及传统中药丸散剂，其药效成分吸收率增加，生物利用度提高［1-2］。因此进一步明确马钱子超微粉抗炎的量效关系对于马钱子超微粉的临床应用具有重要意义。马钱子超微粉毒、效成分复杂，毒性机制不明确，随着药物剂量的递增，机体将相继出现治疗效应、毒性效应，直至死亡效应。出现这3种效应的剂量分别称为有效剂量（ED）、毒性剂量（TD）和致死剂量（LD）。笔者以类风湿性关节炎（RA）大鼠为模型动物，以最大效能（Emax）、效价强度（KD）、治疗指数（TI）、安全界限（SF）为参数，考察微粉化对马钱子疗效与毒性量效关系的影响。

1 实验材料

1.1 试剂与仪器马钱子购自湖南中医药大学第一临床医学院，经鉴定为马钱科植物云南马钱Strychnos pierriana A.W.Hill的干燥成熟种子，其质量符合2010年版《中国药典》马钱子项下规定。马钱子超微粉与其粗粉均采用同一批原料制备而成，批号分别为W20090203、C20090203，临用前以蒸馏水配成混悬液。弗氏完全佐剂由美国Sigma公司提供。YLS-7B型足趾容积测定仪（山东医学科学院设备站）。

1.2 实验动物SD大鼠，SPF级，180～200 g，200只，雄性，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号NHASLKJ 20100778，生产许可证号SCXK（湘）2009-0004。全价颗粒饲料由湖南中医药大学SPF实验动物中心提供。动物饲养室温：20～24℃，相对湿度：45%～60%。实验动物环境设施合格证号：SYXK（湘）2009-0001。

2 实验方法

2.1 马钱子超微粉与其粗粉抑制RA大鼠足肿胀的量效关系试验

2.1.1 分组与给药SD雄性大鼠78只，适应性饲养3 d，按体质量随机分为13组：空白组、模型组、阳性药（雷公藤多苷片8.0 mg/kg）组、受试药物（马钱子超微粉与其粗粉各为50.0、35.0、24.5、17.2、12.0 mg/kg）组。所有动物于造模前测定左、右后部足趾容积，除空白对照组外，其余各组动物右后部足趾注射弗氏完全佐剂0.1 mL，复制类风湿性关节炎大鼠模型［3］。造模1 h后按10 mL/kg灌胃给药，模型对照组与空白对照组给予等剂量的蒸馏水，每天给药1次，连续给药21 d。

2.1.2 观测指标分别于造模24 h，6 d，12 d，15 d，21 d测量各组大鼠右后部足趾容积，于造模后12 d，15 d，21 d测量各组大鼠左后部足趾容积。

2.1.3 马钱子超微粉与其粗粉抑制RA大鼠足肿胀的ED50、ED95以大鼠右后部足趾容积与左后部足趾容积计算足肿胀率、足肿胀抑制率及效应率，根据量效关系实验结果 进行线性回归，Bliss法计算马钱子超微粉与其粗粉的ED50及ED95。足肿胀率（%）=（右后部足趾容积－左后部足趾容积）/左后部足趾容积×100%。足肿胀抑制率（%）=（模型组足肿胀率－给药组足肿胀率）/模型组足肿胀率×100%。药物效应率（%）=某剂量的抑制率/最大抑制率×100%。

2.2 急性致死量试验

2.2.1 剂量确定经预实验得SD大鼠马钱子超微粉最低全致死量Dm为207.4 mg/kg、最高不致死量Dn为83.3 mg/kg，马钱子粗粉最低全致死量Dm为259.0 mg/kg、最高不致死量Dn为104.2 mg/kg。按组间等比关系，把马钱子超微粉按1∶0.7961分为207.4、165.1、131.4、104.6及83.3 mg/kg 5个剂量组，粗粉按1∶0.7964分为259.0、206.3、164.3、130.8及104.2 mg/kg 5个剂量组。

2.2.2 分组及给药SD雄性大鼠100只，SPF级，体质量18～22 g，按体质量分层随机分为10组，每组10只，马钱子超微粉与其粗粉各5组，禁食12 h后一次性灌胃上述剂量的马钱子超微粉或其粗粉，灌胃体积10 mL/kg，然后正常饲养并观察14 d，记录期间各组动物的死亡数。以Bliss法计算马钱子超微粉与其粗粉的LD50及LD5。

2.3 安全范围计算按照以下公式计算大鼠灌胃马钱子超微粉与其粗粉的治疗指数TI=LD50/ED50，安全界限SF=LD5/ED95。

3 结果

3.1 马钱子超微粉与其粗粉抑制RA大鼠足肿胀的量效关系曲线

3.1.1 马钱子超微粉与其粗粉抑制RA大鼠足肿胀的作用见表1。结果 示马钱子超微粉与其粗粉均可明显抑制弗氏完全佐剂导致的大鼠足肿胀。马钱子超微粉在12.0～24.5 mg/kg范围内，量增效增；在35.5～50.0 mg/kg剂量范围内，量增效减。其粗粉在12.0～35.0 mg/kg剂量范围内，量增效增；50.0 mg/kg剂量，量增效减。相同剂量的马钱子超微粉药效明显优于其粗粉，且其最小有效剂量小于粗粉。在马钱子超微粉24.5～50.0 mg/kg剂量范围量增效减的原因，可能是给药剂量超过了最大安全剂量，导致毒性反应，从而降低了其药效。

表1 各组RA大鼠足肿胀情况比较（±s）

表1 各组RA大鼠足肿胀情况比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别抑制率（%）效应率（%）模型组--剂量（mg/kg）肿胀率（%）-58.2±13.5雷公藤多苷片32.696.4 n66 20.039.2±6.6马钱子超微粉612.051.4±7.311.734.6马钱子超微粉617.246.4±11.720.360.1马钱子超微粉624.538.5±13.0*33.8100.0马钱子超微粉635.041.1±5.7**29.487.0马钱子超微粉650.050.3±12.313.640.2马钱子粗粉612.062.3±12.8-7.0-24.6马钱子粗粉617.258.6±11.6-0.7-2.5马钱子粗粉624.547.3±10.918.765.6马钱子粗粉635.041.6±17.628.5100.0马钱子粗粉650.049.9±14.914.350.2

3.1.2 线性拟合［4-5］见图1。在马钱子超微粉及其粗粉的量增效增剂量范围内，采用线性拟合方法 分别分析其量效关系。结果 表明，马钱子超微粉及粗粉的剂量与其效应率呈正比。

图1 马钱子超微粉及粗粉效应率的线性拟合曲线

图2 马钱子超微粉抑制RA大鼠足肿胀的量效曲线

3.1.3 多项式曲线拟合见图2及图3。在马钱子超微粉及粗粉的全剂量范围内，采用多项式曲线拟合方法 ，分析其足肿胀抑制率的量效关系。

马钱子超微粉与其粗粉足肿胀抑制率量效曲线拟合方程为：

超微粉：Y=-0.167X2+10.441X-66.082，R2=0.9418。当剂量为31.26 mg/kg时，其最大效能Emax=97.11%，效价KD=14.21 mg/kg，斜率为5.69。

粗粉：Y=-0.2194X2+15.911X-194.51，R2=0.9571。当剂量为36.26 mg/kg时，其最大效能Emax=93.96%，效价KD=21.63 mg/kg，斜率为6.42。

马钱子超微粉的Emax较其粗粉大，提示，马钱子超微粉抑制足肿胀的药效优于其粗粉；马钱子超微粉的KD较其粗粉小，即马钱子超微粉的效价强度增大，提示，马钱子超微粉50%Emax所对应剂量较其粗粉小（可减少34.3%），马钱子超微粉临床使用剂量可以减低至其粗粉的2/3；斜率减小，表明马钱子超微粉的有效剂量范围增大了1.13倍。

图3 马钱子超微粉与其粗粉效应率拟合曲线

从图3可知，马钱子超微粉ED50=14.3（95%可信区间为13.4～15.1），ED5=8.5，ED95=24.1；其粗粉ED50=23.2（95%可信区间为22.5～23.9），ED5=18.8，ED95=28.6。

3.2 马钱子超微粉与其粗粉的LD50见图4。灌胃马钱子超微粉或其粗粉后，一般大鼠会在约10～20 min出现中毒症状，表现为全身抽搐、或全身僵直，进而出现呼吸停止而死亡，若出现中毒症状后能恢复正常者，则30 min后基本不再复发，并恢复正常活动及饮食。

马钱子超微粉LD50=131.4（95%可信区间为117.01～147.6），LD5=91.6；马钱子粗粉LD50=156.8（95%可信区间为139.69～175.7），LD5=110.4。马钱子超微粉SD大鼠的急性毒性大于其粗粉。

3.3 马钱子超微粉与其粗粉的TI、SF马钱子超微粉与其粗粉急性灌胃给药一次，分别计算得超微粉TI=131.4/14.3=9.2，超微粉SF=91.6/24.1=3.8；粗粉TI=156.8/23.2=6.8，粗粉SF=110.4/28.6=3.9。

结果 提示，马钱子超微粉的治疗指数较其粗粉升高，则表明采用小剂量多次给药形式，马钱子超微粉较其粗粉相对安全；马钱子超微粉与其粗粉的安全界限基本相当，则表明马钱子超微粉与其粗粉一次给药的安全性无明显差异。

图4 马钱子超微粉与其粗粉死亡率拟合曲线

4 讨论

马钱子超微粉的ED50、ED95分别为14.3、24.1 mg/kg，LD50、LD5分别为131.4、91.6 mg/kg；马钱子粗粉的ED50、ED95分别为23.2、28.6 mg/kg，LD50、LD5分别为156.8、110.4 mg/kg。结果 表明，马钱子超微粉与其粗粉的治疗剂量与中毒剂量较为接近，安全范围较窄。马钱子超微粉50%Emax所需剂量较其粗粉小（约0.66倍），其临床使用剂量可以减低至其粗粉的2/3；微粉化使马钱子的有效剂量范围增大了1.13倍。

治疗指数（TI）是衡量药物安全性的一个指标，以LD50与ED50之比来表示。TI越大，相对越安全，一般TI＞3较安全而TI＜2不安全。安全界限（SF）是定量比较一次给药的安全性，以单次给药后的LD5与ED95之比来表示，克服了TI不能反映疗效和毒性的剂量-效应关系的缺点。马钱子超微粉的治疗指数TI=9.2、安全界限SF=3.8，其粗粉的治疗指数TI=6.8、安全界限SF=3.9。结果 提示，马钱子超微粉与其粗粉小剂量多次给药相对较安全，且马钱子超微粉小剂量给药较其粗粉相对安全。马钱子超微粉与其粗粉的安全界限接近，马钱子超微粉与其粗粉一次给药的安全性基本相当。

《中国药典》收载的马钱子粉（细粉），由于其安全剂量范围较窄，临床应用受到限制。本试验结果 表明，马钱子微粉化后最小有效剂量降低、安全剂量范围增大，临床可用于治疗类风湿关节炎等疾病，但仍需要调整剂量，确保安全有效。

［1］ 杜贵友，方文贤.有毒中药现代研究与合理应用［M］.北京：人民卫生出版社，2003：305-306.

［2］ Teske J，Weller JP，Albrecht UV，et al.Fatal intoxication due to brucine［J］.Anal Toxicol，2011，35（4）：248-253.

［3］ 饶健，蔡光先，李丹丹，等.五积散的临床和药理作用研究进展［J］.湖南中医药大学学报，2009，29（5）：75-77.

［4］ 王宇红，蔡光先，张水寒.心宁缓释片的质量标准研究分析［J］.测试技术与仪器，2007，13（1）：5-11.

［5］ 王宇红，蔡萍，张水寒，等.心宁缓释片的HPLC指纹图谱研究［J］.湖南中医杂志，2007，23（2）：77-79.