康丽菲 朱桂云 李秀武 许志明 李晓霞 安晓颖 刘娜

目前，用于结核分枝杆菌耐药性的检测方法主要以培养为基础的绝对浓度法或比例法，需要2～3个月才能得到结果，延误了患者及时准确用药，因此不能完全满足临床需要。创建快速、简便、准确的检测方法对临床治疗有积极意义。基因芯片技术正是为了满足这种需求，用于结核分枝杆菌耐药性检测，对辅助用药有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料 收集我院临床诊断结核病标本21例，包括痰13例，肺泡灌洗液6例，伤口分泌物2例。均经过培养得到分离菌液。

1.2 仪器与试剂 ExtractorTM36核酸提取仪，Hybset基因微阵列芯片杂交盒BioMixerTMII，PCR扩增仪TC-25/H，离心机和离心干燥芯片的容器SliderWasherTM8，微阵列芯片扫描仪Lux-Scan 10K-B，基因芯片(利福平检测rpoB基因，异烟肼检测katG和inhA基因)及洗液SSC和SDS，核酸提取液，PCR扩增试剂1、2、3，杂交缓冲液，均购自北京博奥生物有限公司。

1.3 方法 痰及肺泡灌洗液样本处理:向盛有痰样的无菌盒中加入1～2倍4%NaOH，震荡混匀，15～20 min后加入pH值6.8磷酸缓冲液混匀，离心后去上清，沉淀再加入0.5～1 ml磷酸缓冲液混匀，接种，培养。分泌物样本处理:加入1～3倍体积4%H2SO4，混匀，静置20～25 min，接种，培养。所有标本进行细胞培养后，一部分继续做药敏试验检测，一部分直接做基因芯片检测。培养后基因芯片技术检测的过程:培养后，吸取≥1个麦氏浊度的菌悬液10～20 μl，于含核酸提取液的核酸提取管中，使用核酸提取仪快速震荡5 min，95℃水浴5 min，5 000 r/min离心1 min，得到的核酸扩增，每个样品进行3管PCR反应，将 PCR 扩增试剂 1、2、3 分别按 18 μl/管分装于200 μl离心管或八连管中，再加入模板DNA各2 μl于3管中，进行扩增(扩增程序37℃ 10 min 1个循环，94℃ 10 min 1个循环，94℃ 15 s→ 60℃ 30 s →72℃ 40 s，45 个循环，94℃30 s→72℃60 s，10个循环，72℃ 7 min 1个循环，4℃ 1个循环)，(PCR产物1为对照产物，PCR产物2为rpoB基因的扩增产物，与利福平微阵列相对应，PCR产物3为KatG基因及inhA基因启动子的扩增产物，与异烟肼微阵列相对应)。

将杂交缓冲液9 μl/管，分装于2管中，将PCR产物1和2各3 μl放于杂交缓冲液的管中(杂交反应混合物R检测利福平)，PCR产物1和PCR产物3各3 μl放于杂交缓冲液的另一管中(杂交反应混合物H检测异烟肼)，将杂交反应混合物加热至95℃，再变性5 min后立即放于冰水混合物中3 min。提前向杂交盒中加入200 μl的蒸馏水，放好芯片及盖片预热50℃。将杂交反应混合物从冰浴中取出，经杂交盒盖片的加样孔加入13.5 μl杂交反应物，微阵列1和3加入杂交反应混合物R，微阵列2和4加入杂交反应混合物H，立即把密封好的杂交盒放入杂交仪中50℃，120 min，再进行芯片洗涤(洗液Ⅰ:依次将20*SSC、蒸馏水、10%SDS，按照 10∶88∶2的比例混合，洗液Ⅱ:将20*SSC、蒸馏水按1∶99的比例混合，洗液Ⅰ清洗1次，30℃，120 s，洗液Ⅱ清洗2次，30℃，60 s)与甩干，最后上机扫描。

2 结果

2.1 利福平耐药检测 21例中，利福平rpoB基因10例突变型(图1)，10例野生型(图 2)，1例无法判读。总突变率47.6%，其中9例为531位点的(C-T)突变，1例526位点的(CG)突变。与药敏实验的符合率为81.0%。利福平的11例耐药株中，基因芯片检测8例为突变型，突变率72.7%，在利福平的10例敏感株中，基因芯片检测2例为突变型，突变率20.0%。

2.2 异烟肼耐药检测 21例中，异烟肼基因有6例突变型，15例野生型(图3)，总突变率28.6%，其中4例为KatG 315(G-C)突变(图4)，占 66.7%，2例为 inhA-15(C-T)突变(图 5)，占33.3%。与药敏实验的符合率为90.5%。在异烟肼的6例耐药株中，基因芯片检测5例为突变型，突变率83.3%，在异烟肼的15例敏感株中，基因芯片检测1例为突变型，突变率6.7%。

图1 利福平ropB突变

图2 利福平野生型

图3 异烟肼野生型

图4 异烟肼katG突变

图5 异烟肼inhA突变

3 讨论

结核病的临床诊疗中，利福平和异烟肼是抗结核的一线药物，但近几年随着结核病的发展，结核分支杆菌对药物的抗药性逐渐增强。结核分支杆菌的耐药性是由相关基因突变引起的。因此一线药物的耐药性检测对于临床治疗结核病有积极意义。传统药敏实验检测结核耐药有一定的缺陷，如耐药性的界限不统一，时间较长，结核菌培养期间可能发生基因突变等。难以满足真正快速检测的需要。基因芯片技术能快速准确的检测结核杆菌耐药性，将检测时间2～3个月缩短到2 d。

基因芯片是指将大量不同的生物信息分子(如寡核苷酸、DNA或cDNA探针等)以高度密集的方式，有序地固定在固相支持物(玻璃片)上形成微阵列。当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，用激光共聚焦荧光扫描对荧光信号的强度进行检测，从而对杂交结果进行量化分析。

结核分枝杆菌利福平耐药主要是由于其作用靶分子RNA多聚酶β亚单位的编码基因rpoB突变所致，且突变一般发生在507位至533位27个氨基酸密码子组成的区域内［1］。其作用机制是通过与结核分枝杆菌RNA聚合酶的β亚单位结合，干扰转录的开始和RNA的延伸。其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸［2］，并且531位点突变＞526位点位点［3］。本实验中利福平的检测基因为rpoB，21例样本中有10例突变，总突变率为47.6%，与药敏实验的符合率为81.0%，低于何敏等［4］的研究结果，其符合率为94.29%。其中531位点突变占90.0%，526位点突变占10%，531位点突变明显高于526位点。11例利福平耐药株中突变率为72.7%，10例利福平敏感株中突变率为20.0%，而崔振铃等［5］研究发现94株利福平耐药株中突变率为81.9%，46株利福平敏感株中突变率为13.0%。1例无法判读，可能存在利福平新的突变位点。

结核分枝杆菌异烟肼耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因katG及烯酰基还原酶编码基因 inhA和 ahpC(羟基过氧化氢还原酶)基因的启动子的缺失或突变有关，其中 katG完全缺失或点突变是最主要的耐药机制，最常见的突变位点是315 位 Ser［6］。

本实验中检测异烟肼基因突变位点KatG 315和inhA-15，21例样本中总突变率为28.6%，而低于谢士达等［7］的研究结果，其异烟肼耐药总突变率为35.5%。本实验中KatG 315突变占66.7%，稍高于与谢士达的结果(62.5%)。大致验证了异烟肼耐药主要是KatG突变。本实验中基因芯片与药敏实验的异烟肼符合率为90.5%。

总之，用基因芯片检测结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的基因突变，快速，准确，敏感性高，特异性强。对临床及时准确进行抗结核治疗具有重要的临床意义。

1 Garcia de Viedma D，del Sol Diaz Infantes M，Lasala F，et al.New realtime PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and highlevel isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，2002，40:988-995.

2 黄海荣，金奇，陈曦，等.中国结核分枝杆菌rpoB基因突变特点.中华结核和呼吸杂志，2001，24:231-235.

3 丁金风，杨渝珍，张先恩主编.基因分析核生物芯片技术.第1版.武汉:湖北科学技术出版社，2004.294.

4 何敏，曾尔良，郑艳燕，等.利用基因芯片检测结核分枝杆菌及其利福平耐药性的研究.中华流行病学杂志，2003，24:385-388.

5 崔振铃，景奉香，胡忠义，等.基因芯片检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性研究.中华结核和呼吸杂志，2004，27:439-441.

6 李桂莲，王撷秀，赵德福.结核分枝杆菌耐药基因的研究进展.中国慢性病预防与控制，2006，14:377-379.

7 谢士达，刘永成，张凤池，等.基因芯片技术快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性.临床肺科杂志，2008，13:147-149.