郑方亮，朱春玉，商玲玲，马杰良，孙婷婷，艾海新，朱俊峰，段艳婷，朱应，刘宏生*

(1.辽宁大学生命科学院辽宁省高校动物资源与疫病防治重点实验室，辽宁沈阳110036;2.辽宁省生物大分子计算模拟与信息处理工程技术研究中心，辽宁沈阳110036;3.武汉大学病毒学国家重点实验室，湖北武汉430072)

禽流感是由A型流感病毒(Avianinfluenza virus，AIV)引起的从呼吸系统病变到全身败血症的一种高度接触性急性传染病，已导致家禽及鸟类的普遍感染并对人类健康造成了严重的威胁［1］。进入21世纪，禽流感在全球愈演愈烈，亚洲、美洲、欧洲的许多国家和地区都曾暴发过此病，在给养禽业造成了巨大损失的同时也使人类处于其危害的阴影之中。禽流感病毒基因组由8个分节段的单股负链RNA组成，共编码11种蛋白。病毒的非结构蛋白NS1(nonstructural protein 1)由该基因组的第8个节段的RNA编码合成，不同病毒株的NS1可编码202～237个氨基酸，相对分子量约为28 ku［2］。2004年美国贝勒医学院的研究人员利用从越南禽流感爆发期间分离出的1个恶性H5N1毒株，确定了全长NS1蛋白的结构。NS1蛋白是一种多功能调节蛋白，在调节流感病毒致病性及毒力方面发挥着重要的作用，NS1蛋白通过与RNA及宿主蛋白的相互作用，可增强病毒mRNA的转录与翻译、抑制宿主蛋白的合成、拮抗宿主干扰素的产生、下调宿主细胞凋亡，改变宿主蛋白的分布、降低宿主抗病毒能力，从而促进病毒粒子的复制和释放，实现病毒的高效感染和高致病性。NS1主要有2个结构域:N-末端的RNA结合结构域(RNA-binding domain，RBD)和C-末端的效应结构域(Effector domain，ED)［3］。NS1蛋白之所以能够发挥多种功能，正是借助这2个功能域，参与病毒感染过程中蛋白-RNA以及蛋白-蛋白间的相互作用实现的。本研究将NS1截短体基因克隆到pET28a原核表达载体，构建重组质粒pET28a-NS1-RBD和pET28a-NS1-ED，在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行优化表达，并对表达的重组蛋白进行纯化和分析，为进一步研究NS1不同结构域与宿主蛋白间的相互作用提供了实验材料和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、载体和菌株H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)由武汉大学病毒学国家重点实验室保存;pET-28a(+)载体购自Novagen公司;pMD18-T载体购自TaKaRa公司;抗His标签抗体购自美国Proteintech Group公司;大肠埃希菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂DNA Marker DL2000、DNA Ploymerase、Reverse Transcriptase、dNTP、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和T4 DNA连接酶均购自TaKaRa;Protein Marker购自MBI;PCR产物纯化(小量)试剂盒、胶回收(小量)试剂盒、质粒(小量)抽提试剂盒以及IPTG均购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司;Ni-NTA His-bind Resins购自Novagen公司;其他试剂为分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒总RNA的提取和纯化将病毒接种于9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔进行增殖，取250 μL含流感病毒的鸡胚尿囊腔上清，根据RNA提取试剂盒(Trizol法)说明书方法，自尿囊液中提取病毒RNA，最后溶于40 μL DEPC处理水。

1.2.2 RT-PCR扩增取病毒RNA 5 μL，以禽流感病毒反转录通用引物Unit 12为引物(5'-AGCAAAAGCAGG-3')，按反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。以所得的cDNA为模板，根据GenBank收录的NS全基因序列(GenBank登录号为AY684710)中NS1编码区序列设计1对引物P1、P2，上游引物P1:5'-ATGGATCCCAACACTGTGTCGAGCTTTCAGGTAGACTGCTTTC-3';下游引物P2:5'-GCGAAGCTTCAAACTTCTGTCTCAATTGTTCT-3'，引物2端分别引入BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点，进行PCR扩增。PCR反应程序:94℃预变性4 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环扩增30次;72℃总延伸10 min。1.2.3NS1基因的克隆和鉴定PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，筛选阳性重组质粒pT-NS1，送华大基因科技有限公司测序。测序结果用NCBI BLAST软件与GenBank中注册的相应基因序列进行比较。

1.2.4 NS1截短体表达质粒pET28a-NS1-RBD，pET28a-NS1-ED的构建根据NS1基因阳性重组质粒测序结果，设计引物，构建NS1截短体表达质粒pET28a-NS1-RBD、pET28a-NS1-ED，下划线部分分别为BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切识别位点。pET28a-NS1(RBD)截短引物:上游引物P3:5'-cgg GGATCCATGGATTCCAACACTGTGTCAAGC-3'，下游引物P4:5'-ccg GAATTC TCAAGACTCCTCCTCCAGAATCCGC-3';pET28a-NS1(ED)截短引物:上游引物P5:5'-cgg GGATCCGATGAGGCACTTAAAATGCCGG-3'，下游引物P6:5'-ccg GAATTC TCAAACTTTTGACTCAATTGTTCTCGC-3'，分别进行PCR扩增。反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环扩增30次，72℃总延伸10 min。PCR扩增出NS1 RNA结合结构域及效应结构域两截短的基因序列，经纯化回收后与pET28a(+)载体连接、转化大肠埃希菌感受态细胞DH5α、双酶切筛选阳性克隆。阳性重组子送华大基因科技有限公司测序。

1.2.5 NS1截短蛋白的诱导表达与纯化将鉴定好的原核表达载体pET28a-NS1-RBD、pET28a-NS1-ED转化表达菌株BL21，挑取阳性菌落接种于5 mL LB(含25 μg/mL卡那霉素)培养液中，37℃振荡培养过夜。次日，取上述过夜菌按1∶100的接种量转接至10 mL新鲜LB培养液中(25 μg/mL卡那霉素)，37℃振荡培养至OD600=0.5～0.7，加入IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)至终浓度为1 mmol/L，37℃继续诱导培养4 h，然后于4℃、8 000 r/min离心10 min收集菌体，PBS重悬，300 W，对悬液进行超声破碎，超声条件:300 W，工作10 s，间隔10 s，重复一定次数，超声破碎至菌悬液变清。4℃，12 000 r/min离心15 min，分别收集上清和沉淀并进行SDS-PAGE检测。按上述方法诱导1 L重组菌，5 000 r/min集菌10 min，1次加入5 mL溶液A洗菌沉淀(溶液A:10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0)，20～30 mL Binding Buffer(含10 mmol/L咪唑)，溶菌酶1.5 mL，PMSF 30 μL，混匀，-70℃反复冻融2次。解冻，超声波细胞破碎仪冰浴下间隙处理菌体，功率200～300 W，至菌悬液变清。4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清，按Novagen Ni-NTA His-bind Resins说明书优化步骤进行纯化，回收基质于4℃保存，将蛋白装入透析袋，浸入双蒸水，于4℃冷库透析过夜，SDS-PAGE检测目的蛋白纯度，并按BIORAD Protein Assay说明书方法绘制蛋白浓度标准曲线，进而测定目的蛋白的浓度。

1.2.6 纯化蛋白的Western blot分析将纯化的蛋白样品经SDS-PAGE电泳后进行电转印，转印条件为90 V 2 h。将转印后的硝酸纤维素膜放入5%脱脂奶粉中进行封闭1 h，将硝酸纤维素膜与抗His标签抗体孵育2 h，用TBST洗涤3次，再与辣根过氧化物酶标记的二抗37℃作用1 h，用TBST洗涤3次，再经TBST洗涤3次后，显色，进行免疫印记分析。

2 结果与分析

2.1 禽流感NS1基因RT-PCR扩增

提取禽流感H5N1亚型RNA，以此为模板，反转录获得cDNA，用引物P1、P2对NS1基因进行PCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，在678 bp处出现一特异条带(图1)，与预计结果一致。

图1 NS1基因RT-PCR电泳结果Fig.1 Agarose gel analysis of NS1 gene RT-PCR

2.2 NS1基因的序列分析

电泳分离鉴定目的基因，按照胶回收试剂盒说明书回收目的产物，克隆到T载体测序鉴定。测序结果表明，采用本研究所设计的引物能特异地扩增出禽流感病毒株A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)的NS1基因序列。NS1基因核苷酸序列长度为678 bp，通过BLAST分析比较，结果表明克隆的NS1序列与其他H5N1分离株同源性可达96%～99%，其中与A/duck/Hubei/2911/2007(H5N1)的NS1基因序列同源性最高达99%。

2.3 NS1截短质粒pET28a-NS1-RBD、pET28a-NS1-ED的鉴定

将NS1截短质粒pET28a-NS1-RBD、pET28a-NS1-ED经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定(图2)，表明NS1截短基因已正确插入到表达载体pET28a中，将重组载体测序，结果表明NS1截短基因没有突变，从而成功构建了NS1截短重组表达载体。

图2 NS1截短质粒的双酶切鉴定Fig.2 Enzyme digestion identification of NS1 truncated plasmid

2.4 NS1截短蛋白的表达与纯化

NS1截短蛋白经IPTG诱导后，4℃，12 000 r/min离心15 min，分离上清和沉淀，分别收集，SDSPAGE电泳检测显示呈现出特异性表达条带(图3)，大小分别约为12、16 ku，与预期结果一致，说明NS1基因的截短体已在大肠埃希菌中得到了高效表达，利用Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对蛋白进行纯化，经SDS-PAGE检测，纯化产物在电泳图上有显著条带(图3)，没有杂蛋白的干扰，表明目的蛋白得到纯化，按BIO-RAD Protein Assay说明书方法绘制蛋白浓度标准曲线，通过绘制的蛋白浓度标准曲线，由紫外分光光度计测得其595 nm处吸光度为0.740，故其浓度为1.6 mg/mL。

2.5 NS1截短蛋白Western blot分析

将纯化的NS1截短蛋白进行SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，进行Western blot分析。结果显示，纯化的NS1截短融合蛋白在12 ku(RBD)，16 ku(ED)位置均出现明显的阳性条带(图4)，表明所表达纯化的NS1截短蛋白特异性表达。

图3 NS1截短蛋白表达产物SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of truncated NS1 expression product

图4 NS1截短蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of the truncated NS1 protein

3 讨论

甲型流感病毒H5N1亚型(influenza A virus subtype H5N1)，是甲型流感病毒的一个高致病性亚型，具有严重的危害性。NS1蛋白是该流感病毒唯一的非结构蛋白，在调节病毒的致病性及毒力方面发挥着重要的作用，它可能是H5N1亚型禽流感病毒高致死率的关键所在［4］。NS1作为一个多功能蛋白质，能与宿主细胞的多种因子发生相互作用，以多种方式解除宿主干扰素防御系统，以拮抗宿主的抗病毒作用［5-6］。另外，NS1蛋白可调控宿主细胞的凋亡，确保病毒能在细胞内有效复制［7］。对NS1蛋白的深入研究不仅有助于更好地了解流感病毒NS1蛋白与其致病力之间的关系，而且为深入探究流感病毒与宿主细胞间的相互关系奠定基础。

A型流感病毒NS1蛋白是唯一的转录后调控子，包括2个功能域，N-末端的RNA结合区和C-末端的效应区。研究发现，NS1蛋白的RNA结合结构域由73个氨基酸组成，核心区由第19～38位氨基酸构成，能够结合异源RNA，包括病毒mRNA的5'非翻译区、病毒基因组RNA、poly(A)RNA和外源dsRNA［8］。RNA结合结构域可通过与mRNA的3'多聚腺苷酸尾结合来抑制成熟细胞的mRNA核输出，或结合U6snRNA、U6atacsnRNA抑制前体mRNA的剪辑，与双链RNA(dsRNA)结合阻止dsRNA激活的抗病毒信号通路，降低宿主细胞的抗病毒活性。此外，NS1蛋白的dsRNA结合区还可与病毒mRNA 5'端的非编码区以及PABP1相结合［9-10］。而位于NS1蛋白效应区上的elF4GI结合位点在位置上靠近于PABP1结合位点，由此推测NS1蛋白与eIF4GI、PABP1及病毒mRNA之间的联合作用能促进病毒mRNA翻译起始复合物的形成，从而增强病毒mRNA的翻译［11］。NS1的效应结构域由129～164个氨基酸组成，第134位至第161位氨基酸为其核心序列。在A型流感病毒感染过程中NS1的C末端效应结构域被认为是NS1与宿主相互作用的主要结构域。该结构域有PDZ结构的结合域，是一种标准的蛋白间相互作用的结构域，在细胞信号转导通路上发挥重要功能，因此PDZ结构域被认为是一种决定流感病毒毒力的重要因子［12］。近来，已有研究证实磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)调节亚基P85β与NS1蛋白存在相互作用，两者的互作能够导致PI3K的激活，并揭示了相互作用的位点是NS1蛋白的效应区以及P85β蛋白的iSH2和SH3区域，同时指出NS1的89位Tyr残基和164位Pro残基是与P85β蛋白相互作用的关键位点［13］。此外，在促进NS1蛋白二聚体形成并巩固其二聚体结构方面，效应区也发挥着重要的作用。

在本实验室前期工作中，已经成功克隆禽流感病毒H5N1全长NS1基因并测序［14］，通过T7噬菌体展示技术筛选到一个与NS1相互作用的宿主蛋白，并利用免疫共沉淀、哺乳动物双杂交、pull down等技术手段进行了体内体外验证试验，确定了2个蛋白之间的相互作用。原核表达具有操作方便、需时较短、表达量大等优点［15］，为了进一步鉴定NS1与宿主蛋白相互作用的结构域及研究两者之间的相互作用方式，本研究利用基因截短技术，将NS1蛋白两结构域分别克隆到表达载体pET28a(+)上构建了重组表达质粒pET28a-NS1-RBD和pET28a-NS1-ED，并进行原核表达，继而通过Ni-NTA蛋白纯化系统成功获得纯化的目标融合蛋白质，并通过Western Blotting进一步确认NS1及截短体蛋白的表达。本研究成功构建了禽流感病毒H5N1亚型的NS1蛋白截短体，并在大肠埃希菌中得到高效表达。这为进一步研究NS1蛋白不同结构域与宿主蛋白的相互作用提供了实验材料，为深入研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础。

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