于素香，孙玉国，王春艳

(承德医学院，河北承德 067000)

叶酸是机体参与核酸合成的重要生化成分，以往临床上主要用于治疗贫血，自上世纪90年代始用于预防胎儿神经管畸形和先天性心脏病等出生缺陷性疾病，因此叶酸预防出生缺陷的机制及安全性成为研究热点。胎盘作为为胎儿提供营养的特有器官，其细胞增殖状态与胎盘发育及胎儿的存活密切相关。增殖细胞核抗原(PCNA）是DNA聚合酶δ的重要辅助因子，在DNA复制、细胞增殖和细胞周期调控中发挥重要作用[1]。已有关于叶酸在体外对胎鼠神经干细胞增殖影响的研究，但未见叶酸对胎盘细胞增殖状况影响的报道。本研究通过观察叶酸对妊娠大鼠胎盘细胞PCNA表达的影响，探讨叶酸对发育中胎盘细胞的作用及机制，为叶酸预防出生缺陷的科学性研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体、二步法免疫组化检测试剂PV-9005、DAB显色剂，北京中杉金桥生物技术限公司;叶酸，上海生物化学制药厂(批号20090207）。

1.2 实验动物分组、受孕、干预和取材 8-10周龄健康清洁级SD大鼠60只(北京大学医学部动物中心提供，合格证号:SCK京1009-0008），体重210-250g，雌鼠40只，雄鼠20只。雌性大鼠随机分为4组:对照组、大、中、小剂量叶酸组，每组10只。所有大鼠于普通笼具中适应性喂养一周后，按雌雄2:1比例合笼，次晨观察到阴栓者确定为受孕，记为E 0.5d。从受孕之日起，大、中、小剂量叶酸组大鼠分别给予叶酸2mg/kg/d、1mg/kg/d、0.5mg/kg/d灌胃;对照组大鼠给予等容积生理盐水。各组孕鼠于E 13.5d取材，每只孕鼠随机取一个胎盘，Bouins液固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。

1.3 HE染色 常规HE染色，Olympus显微镜下观察并摄片。

1.4 免疫组织化学染色及定量分析 采用二步法免疫组织化学染色显示胎盘细胞PCNA的表达，一抗浓度1:100，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。以细胞核出现棕黄色或褐色颗粒为阳性反应。定量分析:应用MiVnt图像分析系统，每张切片随机选取5个高倍视野(×400），计算阳性产物面积占分析面积的比值，取平均值作为PCNA蛋白表达的相对水平。

1.5 统计分析 应用SPSS 13.0统计软件行单因素方差分析，组间比较采用q检验。

2 结果

2.1 胎盘的形态结构 对照组胎盘可观察到组织学分带，结构无紊乱;各叶酸组大鼠胎盘组织结构与对照组比较无明显改变。

2.2 胎盘细胞PCNA的表达 各组孕鼠胎盘均可见PCNA阳性表达，尤其是滋养层细胞PCNA的表达最为明显，阳性产物为棕黄色颗粒状分布于细胞核中。定量分析结果见附表:叶酸3个干预组胎盘细胞PCNA的表达明显高于对照组(P＜0.05）;不同剂量叶酸组之间比较，大、中剂量组明显高于小剂量组(P＜0.05）;大、中剂量组之间比较无显著差异(P＞0.05）。

附表 各组孕鼠胎盘细胞PCNA的表达(±s）

附表 各组孕鼠胎盘细胞PCNA的表达(±s）

与对照组比较:*P＜0.05;与叶酸小剂量组比较:#P＜0.05

组别 n PCNA表达对照组 10 8.52±2.5叶酸大剂量组 10 25.1±9.3*#叶酸中剂量组 10 28.3±6.5*#叶酸小剂量组 10 16.2±5.2*

3 讨论

叶酸是体内生化反应中一碳单位的载体，主要参与DNA和RNA的合成，与细胞增殖密切相关。细胞增殖是胎盘和胚胎生长发育过程中的重要事件，反映胎盘和胚胎细胞增殖状况的指标很多，如PCNA、ki67等，其中PCNA是仅在增殖细胞核内合成或表达的蛋白，其表达量的高低可反映细胞增殖的活跃程度。正常分裂增殖的细胞,G0-G1早期细胞没有明显的PCNA表达,G1晚期PCNA的表达明显增加,S期达到高峰,G2、M期下降。

本研究发现，叶酸干预组胎盘细胞PCNA的表达明显高于对照组，说明叶酸可上调PCNA的表达，表明叶酸具有促进胎盘细胞增殖的作用，并可影响细胞周期的进程。Klingler等[2]的研究发现，大鼠孕期叶酸饮食可增加胎盘重量、促进胎盘发育，同本研究结果一致。有学者研究证实[3]，叶酸以及叶酸代谢物可引起结肠癌细胞株细胞周期的变化，使癌细胞S期细胞数增加，G2/M期细胞数减少，与我们的研究结果一致。说明叶酸可能对胎盘细胞与肿瘤细胞具有类似的作用，通过改变细胞周期使S期细胞数增多，从而促进细胞增殖。

肖文林等[4]利用RNA干扰技术研究发现，不同浓度的叶酸对胚胎腭突细胞(MEPM)增殖作用的影响不同，叶酸浓度对细胞的增殖程度在一定范围内具有剂量依赖性。本研究也显示了不同剂量叶酸组PCNA表达的差异性，提示叶酸促进细胞增殖的效应与剂量有关。Pickell等[5]的研究发现，叶酸摄入过高可能干扰鼠胚胎发育，导致胎鼠发育迟缓、胎鼠缺陷、死胎等妊娠结局。因此推测，叶酸剂量过大可能会抑制细胞增殖。

综上所述，给受孕大鼠灌服一定剂量的叶酸，可提高胎盘细胞PCNA的阳性表达，促进胎盘细胞增殖，有助于胎盘发育。有关叶酸、PCNA及细胞增殖之间的量效关系及确切作用途径，有待于深入研究。

[1]Grossi F,Loprevite M,Chiaramondia M,et al.Prognostic significance of K-ras, p53, bcl-2, PCNA,CD34 in radically resected non-small cell lung cancers[J].Eur J Cancer,2003,39(9):1242-1250.

[2]Klingler M, Blaschitz A, Campoy C,et al.The effect of docosahexaenoic acid and folic acid supplementation on placental apoptosis and proliferation[J].Br J Nutr,2006, 96(1):182-190.

[3]Mathers JC.Reversal of DNA hypomethylation by folic acid supplements:possible role in colorectal cancer prevention[J].Gut,2005,54(5): 579-581.

[4]肖文林，石冰，郑谦，等.叶酸拮抗亚甲基四氢叶酸还原酶基因沉默的实验研究[J].实用口腔医学杂志,2010,26(1):15-19.

[5]Pickell L, Brown K,Li D,et al.High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice[J].Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2011, 91(1): 8-19.