张耀中，刘卉琳，兰时乐，李琦，3，刘绍，4*

(1.湖南农业大学生物安全与技术学院，湖南长沙410128;2.湖南农业大学生物科技学院，湖南长沙410128;3.湖南利尔康生物有限公司，湖南岳阳414100;4.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128)

酸碱指示剂［1］是指在一定pH值范围内能显示一定颜色的试剂。工作和实验上常用的酸碱指示剂有酚酞、甲基橙、石蕊等［2-3］。实验室常用的指示剂种类较少，有的变色也不灵敏，来源有限，且污染环境。近年来，越来越多的新指示剂被应用到酸碱滴定中［4-5］。在自然界里，有许多微生物产生的色素在不同的酸碱性溶液中，都会发生颜色的变化，并且它们来源广泛，廉价易得，天然环保［6］，因此从自然界发现能够产生酸碱指示剂的微生物对保护自然环境和微生态系统具有重大意义。本实验旨在对1株能够产生酸碱指示剂的真菌进行鉴定和研究，为后续研发微生态指示剂提供一定的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒菌株A-01和Escherichia coil DH5α均由湖南农业大学生物科学技术学院实验室提供，pGEM-T easy Vector购自Promega Bioteeh Co.，Ltd。

1.1.2 培养基PDA培养基;Gorodkowa培养基;LB培养基。

1.1.3 质粒提取液溶液Ⅰ:葡萄糖50 mmol/L，Tris.Cl(pH 8.0)25 mmol/L，EDTA(pH 8.0)10 mmol/L，分装后高压灭菌15 min，4℃保存;溶液Ⅱ:NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%(质量体积比);溶液Ⅲ:5 mol/L CH3COOK 60 mL，CH3COOH 11.5 mL，ddH2O 28.5 mL，pH 4.8;RNaseA:10 mg/mL溶于10 mmol/L Tris.Cl(pH 7.5)和15 mmol/L NaCl中，加热15 min，－20℃保存;TE缓冲液(pH 8.0):Tris.Cl(pH 8.0)10 mmol/L，EDTA(pH 8.0)1.0mmol/L，灭菌。

1.2 方法

1.2.1 酸碱指示剂变色范围的确定取待鉴定菌株接种进行液态培养，将菌株接种至马铃薯液体培养基中，28℃下培养7 d。在无菌环境下，将培养好的菌液进行过滤，取滤液。参照文献［7］提供的方法研究滤液在不同pH值时的颜色变化。

1.2.2 形态学特征鉴……