黄辉，汤斌

(安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖241000)

纤维素是世界上最大的可再生资源，通过降解可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大现实意义［1-3］。利用微生物产生的纤维素酶(cellulase)来分解和转化纤维素则是纤维素利用的有效途径。纤维素酶由内切葡聚糖苷酶(EG)、外切葡聚糖苷酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)3种组分构成［4-5］。各组分协同作用，可以将木质纤维素水解为葡萄糖。其中EG优先作用于无定形纤维素，切割β-1，4主键，进而由外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶完成彻底降解［6］。目前，纤维素酶基因的克隆与表达的研究已经成为纤维素酶分子生物学研究的热点［7-8］。随着纤维素酶分子生物学的研究不断深入，越来越多的纤维素酶基因被克隆与表达。来源于纤维素降解微生物的纤维素酶基因的异源表达，使用最多的宿主就是大肠埃希菌和毕赤酵母。然而，在安全性、生产技术及蛋白分泌等方面，枯草芽胞杆菌比大肠埃希菌更具作为表达宿主的优势［9］。由于枯草芽胞杆菌自身分泌蛋白酶多，容易对获得目的蛋白产生影响。本研究选择缺失6种胞外蛋白酶基因(中性蛋白酶A、枯草溶菌素、胞外蛋白酶、金属蛋白酶、杆菌肽酶F和中性蛋白酶B)的枯草芽胞杆菌WB600作为宿主菌，最终成功得到表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和引物葡枝根霉TP-02是从黄山生态林腐烂的枯草中筛选并保存［10］。用于双链合成的含有HindⅢ酶切位点的锚定引物:5＇-(T)18AAGCTT(AG)10，由上海生物工程技术服务公司合成。……