陈飞，吴红艳，桓明辉，关艳丽，郭玲玲，于广峰

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000)

Tetramycin是链霉菌(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis subsp 11371)产生的具有抗真菌作用的抗生素，但产Tetramycin的能力低，生产成本高，不能满足市场需求。研究表明，Tetramycin的抗性基因参与了抗生素的合成调控，与抗生素合成基因成簇并存，在抗生素合成过程中起激活或限速作用，且抗性水平与抗生素合成呈正相关［1-2］。据此，本文对Tetramycin抗性基因进行了克隆及生物活性的测定，为进一步研究Tetramycin生物合成基因簇、提高Tetramycin产量提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株链霉菌11371(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis subsp 11371)菌株，由辽宁省微生物科学研究院菌种保藏中心提供;大肠埃希菌DH5α，购自科海军舟生物制品公司;毕赤酵母菌种GS115，毕赤酵母表达载体pPICZαA，由首都医科大学朱俊平博士惠赠。

1.1.2 培养基LB培养基，YEPD培养基，YEPDS培养基，高氏一号培养基。

1.1.3 试剂溶菌酶、X-gal，IPTG，Taq酶，T4-连接酶，限制性内切酶XbaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、Sau3AⅠ、博来霉素(Zencin)等购自北京科海军舟有限公司;Tetramycin由辽宁省微生物科学研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 抗性基因的克隆及序列测定［3-4］①链霉菌11371基因组DNA的提取:提取链霉菌基因组DNA，沉淀溶于0.1×SSC中，－20℃保存备用［5］;②链霉菌11371抗性基因PCR扩增:不同链霉菌次级代谢中抗性基因具有一定同源性，根据已知链霉菌抗性基因的保守核苷酸序列设计简并引物，以链霉菌11371基因组DNA为模板进行克隆，获得链霉菌11371抗性基因片段1-2-1和2-1-1;③抗性基因扩增产物纯化:PCR产物可以直接利用纯化试剂盒进行纯化;④抗性基因扩增产物酶切:按照表1均匀混合各溶液，37℃保温1～3 h;⑤抗性基因酶切片段与载体pUCm-T连接:根据Taq酶PCR扩增产物末端有A碱基与pUCm-T线性载体末端T碱基配对的特点，摸索扩增产物和载体的连接比例，按照T4-连接酶反应条件，进行纯化产物与载体DNA的连接。……