张延平 张晓强 刘雅莉 黄玮 孙玉蕊

1 中国人民解放军第309医院耳鼻咽喉科(北京 100091)； 2 河南省医学情报研究所； 3 河南省卫生厅

GJB2基因位于染色体13q12，编码缝隙连接蛋白26(Connxin 26, Cx26)，是构成细胞间缝隙连接(gap junction)的重要组成部分。Cx26在哺乳动物耳蜗中广泛存在，它所构成的纯合缝隙连接和杂合缝隙连接在维持耳蜗正常生理功能中起重要作用。近年来的研究发现该基因突变是导致人类非综合征型聋(nonsyndromic sensorineural hearing impairment,NSHI)的主要原因之一。目前已经报导的人类GJB2突变已经超过120种，其中绝大多数为功能丧失性突变[1]。为了探讨GJB2突变导致耳聋的机制，研究者先后报道了三种GJB2条件敲除小鼠的动物模型，即Cx26loxP/loxP OtogCre[2], Cx26loxP/ loxP Pax2-Cre和Cx26loxP/loxP foxg1-Cre小鼠[3]。上述三种动物都是耳蜗中特异性缺失Cx26表达，动物出生时内耳发育正常，毛细胞在听觉开始后不久出现死亡，听觉发育成熟后出现耳聋，经检测，凋亡相关蛋白caspase 3在P17时的动物耳蜗细胞中表达阳性，提示凋亡可能是毛细胞死亡的主要原因[2]。上述研究主要关注整个耳蜗的细胞死亡情况，并没有详细探讨外毛细胞的凋亡情况。因此本研究利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)鳌和的鬼笔环肽(phalloidin )和碘化丙啶(propidium iodide，PI)联合染色技术，研究GJB2基因条件敲除小鼠听觉发育成熟前后不同时期的基底膜毛细胞变化情况，为进一步研究凋亡在敲基因动物耳聋发病中的作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 GJB2基因条件敲除小鼠cCx26loxp/loxp-Pax2-Cre(cCx26ko)由转基因小鼠Cx26loxp/loxp与 Cx26loxp/--Pax2-Cre小鼠(均由美国Emory大学林曦教授实验室提供)杂交获得，野生型BALB/c小鼠作为正常对照，动物统一编号，统一喂养，双盲法测定，分别选取P8、P14、P18和P21四个发育阶段各6只小鼠进行实验，出生后第3天剪鼠尾提取基因组DNA确定基因型(方法及结果略)。……