张红艳，李彦姝，姚远，王春玉，王迪，李丰

(1．中国医科大学细胞生物学教研室，卫生部细胞生物学重点实验室，教育部医学细胞生物学重点实验室，辽宁沈阳 110001;2．辽宁省人民医院 消化内科，辽宁 沈阳 110016)

LIM基因是指含有LIM结构域的一大类基因，LIM结构域含有大约55个氨基酸，由两个串联的可与锌结合的富含半胱氨酸的基元组成，调节包括LIM同源异形蛋白在内多种蛋白之间的相互作用［1］。现已发现该家族基因主要有 LMO1、LMO2、LMO3、LMO4、dLMO、XLMO、PDLP 等［2］。含有 LIM 结构域的蛋白称为LIM蛋白，哺乳动物LMO蛋白家族共有4个(LMO1～4)，缺少DNA结合域，但是依然能够招募包括转录因子在内的很多蛋白，执行转录调节子的功能［3］。

Kenny等用NL1的LID结构域筛选鼠胚的λ表达文库分离鉴定了LMO4，是LIM转录调节因子亚家族LMO中的新成员，在T淋巴细胞、脑神经脊细胞、体节、背侧肢芽间充质细胞、运动神经元和施万细胞前体细胞中高表达，在胚胎发育中有着重要的调节作用［1］。LMO4在决定细胞命运及肿瘤发生等过程中发挥着重要的作用。LMO4作为转录调节子，在前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等上皮来源的肿瘤中高表达［3-5］。但是人 LMO4(hLMO4)基因，位于染色体1p22.3上［6］，在一些人类的癌症中这一区域被删除掉了，例如，肝癌、皮肤癌、肺癌［7-8］。因此 Setogawa等认为LMO4可能执行肿瘤抑制因子的功能［9］。在本研究中旨在利用基因重组技术构建LMO4的原核表达载体，并鉴定其在E．coli BL21中的诱导表达，为进一步研究LMO4的生物学功能奠定一定基础。

1 材料与方法

1． 1 材料

原核表达载体pGEX-5X-1购自美国Clentech公司;大肠杆菌DH5α和BL21为本实验室保存;Pyrobest TM DNA polymerase，dNTP，DNA电泳凝胶回收试剂盒，限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购自大连TaKaRa公 司;DNA marker、Proteinmarker购 自GenScript公司;T4 DNA连接酶购自NEB公司;DNA测序测定由上海生工生物工程有限公司完成;异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)为Amresco产品;GST抗体购自Cell Signal公司，HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;ECL发光试剂盒购自GE Healthcare公司;其它试剂均为国产分析纯。

1． 2 hLMO4原核表达载体的构建

本实验室通过提取乳腺癌细胞(MCF-7)RNA，逆转录聚合酶链反应获得hLMO4全长编码序列［10］，分别用BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切pGEX-5X-1载体和hLMO4 PCR片段后，凝胶回收纯化产物［11］。将两个片断用T4 DNA连接酶常温连接2 h，然后16℃连接过夜，得到连接产物。取5 μl转化感受态细胞E．coli DH5α中，37℃培养过夜。挑取菌落，接种于3 ml含氨苄西林的Luria-Bertani(LB)培养基中，37℃振荡过夜。用碱裂解法提取质粒DNA，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定重组质粒，质粒DNA送上海生工生物工程有限公司进行测序分析，经测序正确后将构建的质粒命名为pGEX-5X-1-hLMO4。

1． 3 重组质粒的诱导表达

将测序正确的重组质粒pGEX-5X-1-hLMO4和pGEX-5X-1载体分别转化E．coli BL21，涂布于含氨苄霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取转化后的单菌落用碱裂解法制备质粒DNA，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定阳性克隆。将阳性克隆接种到含氨苄霉素LB培养基中，37℃震荡培养过夜后，将菌液按1∶50接种到50 ml氨苄LB培养基，37℃培养至OD 600为0.6左右时(3～4 h)，加入终浓度 1.0 mmol·L－1的IPTG，30℃诱导培养3 h，收集细菌，加入50 μl 1倍稀释的上样缓冲液中，100 ℃加热5 min，4 ℃、10 000 r·min－1离心5 min，冰上放置，取上清进行10%SDS-PAGE电泳。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色后观察诱导结果。

1． 4 GST融合蛋白的纯化

将pGEX-5X-1-LMO4和pGEX-5X-1阳性克隆接种到含有氨苄霉素的LB培养基中，37℃培养过夜后将2 ml过夜菌接种到100 ml LB培养基中，37℃摇菌3 h后加入IPTG，再30℃诱导培养3 h。4℃ 7 000 r·min－1收集细菌，用2 ml细菌裂解液充分重悬细菌，超声破碎30 s，冰上孵育30 min，4 ℃、10 000 r·min－1离心5 min。取上清加入 GST-beads，4℃旋转孵育 3 h，4℃、500 r·min－1离心2 min。收集 GST-beads，使用 NP-40缓冲液清洗GST-beads 3次，每次10 min，然后加入与GST-beads等体积的NP-40缓冲液。取10 μl纯化蛋白，加入2倍稀释的上样缓冲液，100℃加热5 min，4 ℃、10 000 r·min－1离心5 min，冰上放置，取上清进行10%SDS-PAGE电泳。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色后观察纯化蛋白表达。

1． 5 Western blot检测

将诱导表达蛋白经10%SDS-PAGE凝胶分离，4℃40 V恒压转膜过夜，用5%脱脂奶粉常温封闭1 h［12］，加入 anti-GST 抗体(1∶2 000)，室温孵育 2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min。ECL显色观察结果。

2 结 果

2． 1 hLMO4重组原核表达质粒的构建及鉴定

重组质粒pGEX-5X-1-hLMO4经 BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后得到约4 900 bp和500 bp左右的两条带，与预期结果相符(图1)，并经测序鉴定正确，无移码突变。

图1 重组质粒pGEX-5X-1-hLMO4酶切分析Lane 1．Lambda DNA marker;Lane 2，3，4．Recombinant plasmid pGEX-5X-1-hLMO4 digested by BamHⅠ and XhoⅠFig 1 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pGEX-5X-1-hLMO4

2． 2 原核表达质粒在E．coli中的诱导表达

构建融合表达质粒pGEX-5X-1-hLMO4在BL21 E．coli中经IPTG诱导表达，在大约49 000 Da处出现一条明显的特异性蛋白条带(图2)。

图2 SDS-PAGE电泳分析GST-hLMO4在E．coli BL21中诱导表达Lane 1，3．Without IPTG induced pGEX-5X-1-hLMO4;Lane 2，4．IPTG induced pGEX-5X-1-hLMO4;Lane 5．Protein molecular weight markerFig 2 SDS-PAGE analysis of induction expression of GST-hLMO4 fusion protein in E．coli BL21

2． 3 原核表达质粒在E．coli中的诱导纯化IPTG-5X-1-5X-1-hL

诱导pGEX和pGEXMO4在BL21 E．coli中大量表达，利用 GST-beads对 GST及GST-hLMO4融合蛋白进行纯化(图3)。1列为蛋白分子量标记，在蛋白标准50 kDa所在位置，﹡处出现明显的特异性蛋白条带(49 000 Da)，是GST(26 000 Da)与LMO4(23 000 Da)分子质量之和，﹡指示纯化的GST-hLMO4融合蛋白。

图3 SDS-PAGE电泳分析GST和GST-hLMO4在E．coli BL21中诱导纯化Lane 1．Protein molecular weight marker;Lane 2．the purification of GST-hLMO4 protein;Lane 3．the purification of GST proteinFig 3 SDS-PAGE analyse the purification of GST and GST-hLMO4 fusion protein in E．coli BL21

2． 4 Western blot鉴定融合蛋白的表达

使用anti-GST单克隆抗体进行Western blot鉴定纯化融合蛋白的表达(图4)，﹡表示纯化的GST-hLMO4，分子质量大约为49 000 Da，1列代表阴性对照，为纯化的GST蛋白，在相对应的2列﹡位置上没有蛋白表达。

图4 使用anti-GST抗体对融合蛋白GST-hLMO4表达进行Western blot检测Lane 1．The purification of GST protein;Lane 2．The purification of GST-hLMO4 proteinFig 4 Western blot detect the expression of GST-hLMO4 fusion protein using anti-GST mAb

3 讨 论

LMO4是由两个串联的不含有DNA结合域的LIM结构域组成的，与多种蛋白相互作用，在多种蛋白复合体中扮演着桥梁因子的作用。它能够将辅抑制子(例如 MTA1、辅因子 CtIP 及 BRCA1［13］)招募到转录因子上，抑制转录活性。另外，LMO4通过招募活性因子或者减少招募辅抑制子来促进转录活性，例如BMP7［14］。目前已经证实，能与其发生相互作用的蛋白还包括核内普遍存在的 Lbd1［15］、DEAF1［16］、HEN1［17］、Get-1［18］等。这些研究提示LMO4作为转录调节子，在不同肿瘤中发挥着多重功能，一方面作为致癌基因促进细胞增殖，另一方面作为肿瘤抑制子促进细胞凋亡，在哺乳动物正常发育和肿瘤形成过程中起着重要的调控作用。

Racevskis等［19］发现LMO4是人类乳腺癌的一种自身抗原，可引起细胞增殖，增强细胞侵袭能力，从而直接导致乳腺细胞癌变。Sum等［13］报道，10种乳腺癌细胞株中，有5种细胞株LMO4 mRNA高表达，原位杂交检测177例乳腺癌样本，56%LMO4高表达。在口腔癌侵袭前沿LMO4表达上调，提示LMO4在癌症细胞侵袭中扮演重要角色［20］。与非肿瘤的胰腺导管细胞株相比，14种胰腺癌细胞株中，有9株高表达LMO4，原代培养的胰腺成纤维细胞也高表达LMO4［3］。

本研究中采用pGEX-5X-1原核表达载体，此类载体含有高效的原核表达启动子，能够在E．coli体内高效表达重组蛋白。本实验成功构建了pGEX-5X-1-hLMO4表达质粒，并建立GST-hLMO4体外纯化表达系统，利用体外纯化蛋白可进行生物学实验研究，例如GST pull-down验证蛋白相互作用，体外激酶实验验证磷酸化等，为深入探讨LMO4在肿瘤中的生物学作用提供了可靠的研究手段和实验依据。

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