张 科 李淑英 丁广成 赵 莹 刘文博 张云茹

(河北联合大学基础医学院，河北 唐山 063000)

人乳头瘤病毒(HPV)属DNA病毒，与许多部位鳞状上皮细胞良性及恶性肿瘤性病变有关，其中HPV感染与宫颈癌的相关性已得到公认。研究显示，食管癌组织中有HPV基因存在。病毒整合是恶性进展的一个标志，大部分肿瘤含一些整合的HPV拷贝〔1～3〕，HPV整合常引起HPV E2阅读框架(ORF)的断裂或缺失，使E6和E7表达升高，有利于恶性转化。为进一步探讨HPV感染与食管癌发生的相关性，本研究应用实时荧光PCR扩增，检测了食管癌患者组织标本中HPV的整合状态及病毒载量。

1 材料与方法

1.1 材料 河南省林州市食管癌患者手术切除组织标本55例，男21例，女34例，平均年龄为58(46～68)岁。组织切除后立即放入－70℃冰箱保存。293细胞DNA作为内参的阳性对照;含有HPV16E2基因质粒、HPV16 E6-E7质粒及β-actin质粒本室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 本研究中应用实时荧光PCR的原理是依据下列假设：HPV整合时最常缺失的E2开放阅读框(ORF)的特殊区域，如HPV以游离型形式存在，E2与 E6拷贝数比例相等;如HPV整合在宿主染色体中，E2缺失，E2与 E6拷贝数比例为零;如HPV以游离、整合的混合型形式存在，E2的拷贝数少于E6。E2与E6比率代表HPV整合状态。因此，根据GenBank提供的基因序列设计引物，选择HPV16三个E2基因区和一个E6基因区位点设计HPV16E2和E6引物及β-actin引物(如表1)。委托上海生工合成引物。

1.2.2 组织标本中DNA的提取及质量控制 使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，德国)，按说明书指示，食管癌组织标本经液氮冷冻研磨后，提取组织DNA于-－0℃保存。使用β-Actin作内参进行PCR扩增检测所提DNA的质量。……