廖立敏，刘 月，李建凤，2，王 碧

（1.内江师范学院 化学化工学院，四川 内江 641112；2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室，四川 内江 641112）

响应曲面法用于微波提取柠檬皮渣总黄酮研究

廖立敏1，2＊，刘 月1，李建凤1，2，王 碧1，2＊

（1.内江师范学院 化学化工学院，四川 内江 641112；2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室，四川 内江 641112）

以60℃下烘干的柠檬皮渣为原料，通过响应曲面法设计微波提取柠檬皮渣总黄酮试验方案，考察了乙醇浓度、液料比和微波处理时间对提取率的影响，最终得出微波提取柠檬皮渣总黄酮的最佳工艺条件，即乙醇浓度为60%、液料比为30、微波处理时间为4min.在此条件下进行3次平行试验，结果表明柠檬皮渣总黄酮的提取率高，而且试验的重现性好，此时平均提取率为1.20%.

柠檬皮；总黄酮；响应曲面；微波提取

柠檬、橙皮渣含有丰富的黄酮类化合物，黄酮类化合物具有抗炎、抗动脉硬化、抗癌、抗氧化等多重生理功效［1-3］.将柠檬、橙皮渣中的黄酮类化合物进行提取并加以利用，不仅可以实现其应有的经济价值，而且还能在一定程度上缓解其对当地环境的压力.目前研究者们在提取天然产物中黄酮类化合物方面已经做了许多有意义的工作，涉及到的提取方法主要有有机溶剂回流提取法、酶法辅助提取法、超声波萃取法、CO2超 临界流 体萃取 法等［4-7］.微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质，到达物料的内部维管束和腺胞系统.由于吸收微波能，细胞内部温度迅速上升，使其细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力，细胞破裂加速有效成分的浸出.响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，可以在小区域内采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，计算方便［8］.本文以乙醇为溶剂，采用微波提取柠檬皮渣中的黄酮类物质.在前期研究的基础上，通过响应面法对工艺条件进行优化，为进一步开发利用提供有价值的工艺参数.

1 实验部分

1.1 实验材料

仪器：UWave－1000型微波·紫外·超声波三位一体合成萃取反应仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；T6型新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；BT224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）.

试剂与原料：芦丁（国药集团化学试剂有限公司，含量大于95%）；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铝、三氯化铁、乙醇、镁粉及浓硫酸均为分析纯（AR）；柠檬（购自四川安岳）.

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮类化合物鉴定 盐酸－镁粉反应：在少许样品液中加入少量镁粉，再滴加1～2滴浓盐酸，在沸水溶液中加热2～3min，观察结果［9］.铝盐反应：在少许样品液中滴加1%AlCl3溶液2～3滴，观察结果［10］.浓硫酸反应：在少许样品液中加入少量浓硫酸观察结果［11］.

1.2.2 黄酮类化合物提取与测定 标准溶液的配制：准确称取芦丁对照品12.50mg于50mL容量瓶中，加入75%乙醇溶解，定容摇匀得芦丁标准液，浓度为0.250 0mg／mL.

测定波长选择：精密量取芦丁对照液1.00mL于比色管中，加5%NaNO2溶液0.4mL，摇匀，放置5min，加10%Al（NO3）3溶液0.4mL，摇匀，放置5min，加4%NaOH溶液4mL，再用蒸馏水稀释至10mL，摇匀，放置15min，在波长300～600nm之间扫描，确定测定波长为510nm.

标准曲线的绘制：精确量取芦丁对照品溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00mL 分别于10mL 比色管，75%乙醇定容，在510nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得到标准曲线的回归方程为：A＝11.8110C－0.0108，R2＝0.9995.

总黄酮的提取与测定：柠檬皮洗净后60℃下干燥，粉碎，过60目筛，称取3.000g于一圆底烧瓶中，按设定的液固比加入一定浓度的乙醇，微波功率为400W下处理一段时间后过滤，定容至100mL，吸取1mL显色后蒸馏水定容至10mL，测定吸光度值.根据标准曲线回归方程，得到提取液浓度，总黄酮提取率按下式计算：Et%＝（C×V×n）／W，式中Et%为提取率；C为测得的提取液浓度；V为提取液体积；n为稀释倍数；W 为原料的质量.

2 结果与讨论

2.1 黄酮类化合物的鉴定

黄酮类化合物鉴定试验结果见表1，各现象说明提取液中有黄酮类化合物的存在.

表1 黄酮类化合物鉴定结果Tab.1 Identification results of flavonoid

2.2 黄酮类化合物提取与测定

2.2.1 提取试验方案设计及结果 应用Design Expert 7.0.0软件，采用 Box－Behnken Design设计试验方案，以乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）为自变量，黄酮提取率（Y）为因变量共设立了17个处理组（共5组全“0”水平处理组）.因子编码及水平见表2，由Box－Behnken Design设计方案所得的试验结果见表3（全“0”水平处理两组，共进行14组试验）.

表2 试验因素与水平Tab.2 Factors and levels of experiment

表3 Box－Behnken设计方案及响应值Tab.3 Table 2Box－Behnken design and response values

用Design Expert 7.0.0软件将表3中试验数据进行多元回归拟合，得到提取率对乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）的二次多项式回归模型.对所建立的响应模型进行方差分析，结果见表4.由表4可知，试验选用的模型显著（P＜0.05）；相关系数R＝0.918，说明该模型拟合程度良好，试验误差较小，可以用此模型来分析以乙醇为溶剂采用微波对柠檬皮渣黄酮的提取.

表4 回归模型方差分析Tab.4 Analysis of variance for regression model

回归模型系数显著性检验结果见表5.由表5可知，模型一次项A显著（P＜0.05）、B高度显著（P＜0.01）、C较显著（P＜0.1）；二次项A2显著、B2较显著、C2显著；交互项AC较显著，其他不显著.

表5 回归模型系数显著性检验Tab.5 Significance test for regression coefficient

2.2.2 响应面分析 响应面图形是响应值对各因素所构成的三维空间的曲面图，图1、图2和图3为乙醇浓度（A）、液料比（B）、微波处理时间（C）在其中一个固定时，另外两个对柠檬皮渣黄酮提取率的交互影响曲面图.比较图1、图2和图3的曲面图可知，液料比（B）对柠檬皮渣黄酮提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡，而乙醇浓度（A）和微波处理时间（C）次之，表现为曲线相对平滑.微波处理时间（C）的影响最小，可能是黄酮类化合物在400W微波处理下浸出速度都很大，故提取时间的变化对黄酮提取率影响不显著.比较图1、图2和图3的等高线图可以看乙醇浓度（A）和微波处理时间（C）的交互影响相对较为显著，表现为等高线最密集，结果与方差分析相似.

图1 乙醇浓度、液料比及其交互作用对提取率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration，liquid－solid ratio and their interactions on the extraction yield

2.2.3 优化与验证 根据回归模型，得出柠檬黄酮最佳提取条件为：乙醇浓度为63.33%，液料比为30，微波处理时间为4min，黄酮得率的理论预测值为1.24%.考虑到实际操作的便利，确定柠檬皮中黄酮类化合物的优化提取工艺条件为：乙醇浓度为60%，液料比为30，微波处理时间为4min，重复试验3次，得黄酮提取率分别为1.23%、1.19%、1.17%，平均值为1.20%，与预测值为1.24%基本一致，即该方程与实际情况拟合很好，响应曲面法适用于对柠檬黄酮的微波提取工艺分析和参数优化.

图2 乙醇浓度、提取时间及其交互作用对提取率的影响Fig.2 Effects of ethanol concentration，extraction time and their interactions on the extraction yield

图3 液料比、提取时间及其交互作用对提取率的影响Fig.3 Effects of liquid－solid ratio，extraction time and their interactions on the extraction yield

3 结论

本文采用响应面法设计试验方案，得出柠檬皮渣总黄酮微波法乙醇提取的最佳工艺条件，在此条件下对柠檬皮渣总黄酮进行提取，不但提取率更高，而且试验的重现性好.本文对于天然产物中有效成分的提取研究具有一定的参考价值.

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［6］阳元娥，谭 伟.夏枯草总黄酮超声提取工艺［J］.食品研究与开发，2011，32（4）：31－34.

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Study on microwave extraction of total flavonoids of lemon peel using response surface methodology

LIAO Limin1，2，LIU Yue1，LI Jianfeng1，2，WANG Bi1，2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang，Sichuan 641112；2.Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling，Neijiang，Sichuan 641112）

Lemon peel，which was dried at 60℃，was used as the raw materials in this study.Experiments of extraction with microwave for total flavonoids of lemon peel were planned by response surface methodology.The effects of alcohol concentration，ratio of solution to solid and microwave processing time on the extraction rate were studied.The best conditions of extraction with microwave were obtained.When the ethanol concentration was 60%，the ratio of solution to solid was 30and the extraction time was 4min，the extraction rate reached the maximum.Under this condition，3paralleled experiments were carried out.The results showed that the extraction rates of total flavonoids of lemon peel were high and the experiments with good reproducibility；the average extraction rate was 1.20%.This paper may have a certain reference value for the extraction of active ingredient of natural products.

lemon peel；total flavonoids；response surface；microwave extraction

R284；Q946

A

1000－1190（2012）05－0569－04

2012－04－11.

2012年内江师范学院重点项目（12NJZ01）.

＊通讯联系人.E－mail：wangbi05＠126.com；liaolimin523＠126.com.