皮钰珍 李佳音 贺 亮

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

双酶复合法提取蛋壳膜中透明质酸的研究

皮钰珍 李佳音 贺 亮

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

利用双酶复合法，以胰蛋白酶、木瓜蛋白酶复合提取蛋壳膜中透明质酸，通过响应面试验确定双酶法提取透明质酸的最佳工艺条件：料液比1∶40（m∶V），木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活性比1∶1，酶用量1 240U／g，温度50℃，pH值7.3，提取时间6h。该条件下，蛋壳膜中透明质酸的提取量为12.2mg／g·蛋壳膜。

蛋壳膜；双酶酶解；透明质酸

蛋壳膜是位于蛋壳与蛋清之间的双层纤维状薄膜［1］，是一种以角膜为主体，与黏多糖类相结合的复合蛋白质，其中含有N－乙酰氨基葡萄糖半乳、葡萄糖醛酸、透明质酸、硫酸软骨素等多糖化合物［2］。

透明质酸（hyaluronic acid，简称HA），是一种具有特殊功能的线性大分子黏多糖，广泛存在于结缔组织及某些生物荚膜中。它由葡萄糖醛酸和N－乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成，分子式为（C14H21NO11）n［3］。HA具有较强的保水能力，被誉为理想的天然保湿因子，广泛应用于高档护肤品、洁齿品以及医疗用品［4，5］。但是由于原料资源的限制，目前中国HA的产量不能满足市场需求。许多研究［6］表明在蛋壳膜中已探测到一定数量的HA，占湿膜重量的0.5%～10%，因此，蛋壳膜可作为提取HA的资源。中国每年约产生246万t蛋壳，其中蛋壳膜约为17万t，它们都被视为废弃物。本试验通过酶解蛋壳膜，从中提取有效成分HA，既可以减少对环境的污染，还可以创造经济价值。

1 材料与方法

1.1 原料

鸡蛋壳：沈阳市某蛋糕店；

胰蛋白酶（250U／mg）、Alcalase酶（2 000U／mL）、中性蛋白酶（2 500U／mL）、木瓜蛋白酶（6 000U／mg）、碱性蛋白酶（2 000U／mg）：北京鼎国生物技术有限责任公司。

1.2 试剂

HCl、95%乙醇、100%乙醇、三氯乙酸、葡萄糖醛酸标准品：均为市售分析纯。

1.3 设备

电子分析天平：ALC－210.4，深圳市标雅科技有限公司；

粉碎机：DFT－50，温岭市大德中药机械有限公司；

pH计：PHS－25，上海日岛科学仪器有限公司；

真空旋转蒸发仪：RE－52B，上海亚荣生化仪器厂；

离心机：H－1650，长沙湘仪离心机仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV－2102C，尤尼柯（上海）仪器有限公司；

1.4 试验方法

1.4.1 原料处理

清洗过的蛋壳放置于清水中24h→加入稀HCl→放置2h→搅拌使壳膜分离→清水洗涤蛋壳膜除去酸液→干燥蛋壳膜→粉碎制粉

1.4.2 HA的粗提取

蛋壳膜粉→加入1%～2%氯化钠→90℃下搅拌，保温10min→冷却至室温→调pH值→加酶酶解→离心过滤收集上清液→浓缩→95%乙醇醇沉2次离心留沉淀→1%氯化钠将沉淀溶解→加三氯乙酸→离心收集上清液→浓缩→再次用95%乙醇醇沉2次，离心留沉淀→真空干燥得HA粗品

1.4.3 单因素试验设计方案 在试验过程中分别考察酶用量、pH、温度、酶解时间对HA提取量的影响，以HA提取量为评定指标。

（1）酶用量对HA提取量的影响：取一定量过筛蛋壳膜，在料液比1∶40（m∶V），温度50℃的条件下，酶解6h。二酶活力比1∶1，酶用量取1 000，1 250，1 500，1 750，2 000U／g 5个水平进行试验。

（2）pH对HA提取量的影响：取一定量过筛蛋壳膜，在料液比1∶40（m∶V），二酶活力比1∶1，酶用量1 250U／g，温度50℃的条件下酶解6h。pH 值选6.5，7.0，7.5，8.0，8.5 5个水平进行试验。

（3）温度对HA提取量的影响：取一定量过筛蛋壳膜，在料液比1∶40（m∶V），二酶活力比1∶1，酶用量1 250U／g，pH 7.5的条件下酶解6h。酶解温度取45，50，55，60，65℃5个水平进行试验。

（4）时间对HA提取量的影响：取一定量蛋壳膜，在料液比1∶40（m∶V），二酶活力比1∶1，酶用量1 250U／g，pH 7.5，温度50℃的条件下酶解。酶解时间取3，4，5，6，7h 5个水平进行试验。

1.4.4 响应面试验设计方案 根据Box－Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取对HA提取影响显著的4个因素（酶用量，pH，温度，酶解时间），设计四元三次回归正交旋转组合的响应面分析试验［7］。

1.4.5 HA含量的测定 因为无论何种来源的HA，均由D－葡萄糖醛酸和乙酰氨基－D－葡萄糖按1∶1的摩尔比组成，根据HA的结构计算，葡萄糖醛酸在HA中的含量为48.38%，所以通过测定葡萄糖醛酸的含量即得出HA的含量，葡萄糖醛酸含量采用 Bitter－Muir咔唑法［8，9］测定。

2 结果与分析

2.1 确定最佳酶系组合

选用中性蛋白酶、Alcalase酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶对蛋壳膜进行酶解［10，11］，筛选出最佳酶系组合。

由表1可知，使用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解蛋壳膜所得 HA的提取量最高，分别是11.9，11.5mg／g，因此选用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶组成最佳酶解酶系，进行以下最佳提取工艺的研究。

2.2 双酶酶解的最佳工艺的研究

2.2.1 响应面试验设计 响应面试验因素与水平见表2。

2.2.2 响应面分析试验结果 以酶用量，pH，温度，酶解时间为自变量，以HA提取量为响应值，根据四元三次回归正交旋转设计试验安排，进行27次试验，试验安排与结果见表3。

表1 酶对HA提取量的影响Table 1 The influence of enzyme on the yielding rate of HA

表2 响应面试验因素与水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiment

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Response surface test results

采用Design－Expert软件对试验数据进行回归分析，得到蛋壳膜中提取HA的回归方程：

由表4可知，对HA提取量的方差分析，其线性、平方以及交互项的显著性P＜0.05，回归达到显著水平。图1～3说明响应值与各因素之间存在的显著回归关系。

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for second－order polynomial model fitted to the response variable

图1 酶用量和酶解时间对提取量的交互影响Figure 1 The contour plot of effect of enzyme amount and extraction time on the yielding rate of HA

图2 pH和酶用量对提取量的交互影响Figure 2 The contour plot of effect of pH and enzyme amount on the yielding rate of HA

图3 酶解温度和酶解时间对提取量的交互影响Figure 3 The contour plot of effect of extraction temperature and extraction time on the yielding rate of HA

通过对二次多项式数学模型的解逆矩阵，并结合实际试验操作，确定双酶复合提取蛋壳膜中HA的最佳生产工艺为在料液比1∶40（m∶V），木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活性比1∶1，酶用量为1 240U／g，pH值7.3，温度50℃的条件下酶解时间6h，得到HA的提取量为12.2mg／g·蛋壳膜，通过验证试验，该值与响应面模型的预测值12.5mg／g·蛋壳膜非常接近，表明模型是合理有效的。

3 结论

影响双酶法提取蛋壳膜中HA主次因素顺序：酶解温度＞酶解时间＞pH＞酶用量。最佳酶解提取工艺：在料液比1∶40（m∶V），木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活性比1∶1，酶用量1 240U／g，pH值7.3，温度50℃的条件下酶解6h，HA的提取量可达12.2mg／g·蛋壳膜。

1 赵玉红，韩琳琳，迟玉杰.酶法提取鸡蛋壳膜中透明质酸的研究［J］.食品研究与开发，2008，29（1）：40～43.

2 马朝梅.发酵法生产透明质酸工艺研究［J］.广西工学院学报，2007，9（3）：3～4.

3 颜延宁.鸡冠中透明质酸的提取［J］.广西轻工业，2006，9（5）：40～42.

4 郭育涛，陈斌，江元汝，等.从牛眼玻璃体中分离纯化透明质酸的新方法［J］.精细化工，2008，3（3）：3～4.

5 赵玉红，迟玉杰.蛋壳膜中透明质酸的提取及部分特性研究［J］.食品工业科技，2008（6）：172～174.

6 Long，Frank Daniel，Adams，et al.Preparation of hyaluronicacid from eggshellmembrane：America，6946551.B2［P］.2005－09－20.

7 慕运动.响应面方法及其在食品工业中的应用［J］.郑州工程学院学报，2001，22（3）：91～94.

8 Bitter T，Muri H M.A modified uronic acid carbazole reaction［J］.Anal.biochem，1962（4）：330～333.

9 凌沛学.透明质酸［M］.北京：中国轻工业出版社，2007：15～47

10 胡耀辉.食品生物化学［M］.北京：化学工业出版社，2009：74～79.

11 袁勤生.酶与酶工程［M］.上海：华东理工大学，2005：130～145.

Extracting hyaluronic acid from eggshell membrane with double－enzyme

PI Yu－zhen LI Jia－yin HE Liang

（Food College，Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning110866，China）

The hyaluronic acid was extracted from eggshell membrane by double－enzyme with the complex of trypsinase and papain.Through response surface method，the best extracting conditons of hyaluronic acid were as followed：ratio of solid to liquid 1∶40，amount of enzyme 1 240U／g，reaction temperature 50℃，hydrolysis time 6h，pH 7.3.Under the condition，the hyaluronic acid yielding rate reached 12.2mg／g.

eggshell membrane；double－enzyme enzymic hydrolysis；hyaluronic acid

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.010

皮钰珍（1974－），女，沈阳农业大学副教授，博士。E－mail：yuzhen＿pi＠sina.com

2011－04－11