赵仙华

（丹阳市第二人民医院，江苏 丹阳 212300）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

Salmonella enterica serovar Typhi GIFU10007野生株和phoP 缺陷株，Escherichia coli SPY372λpir，Escherichia coli DH5α。

1.1.2 引物

在mig－14基因上游和下游设计两对特异性PCR引物：P1A／P1B和P2A／P2B。根据treC，eutG和otsB 基因序列设计RT－PCR引物。

1.1.3 主要试剂

限制性内切酶BglII、BamHI、T4DNA Ligase、碱性磷酸酶、Ex Taq、dNPT、Ex Taq Buffer、RNase H、X－Gal、DL2000。

1.1.4 主要仪器

PCR仪，高速冷冻离心机，凝胶成像及分析系统，核酸检测仪，电穿孔仪，电热恒温干燥箱，超纯水分离系统：PL5243（PALL），超低温冰箱，GenePix Personal 4100A 芯片扫描仪。

1.2 方法与步骤

1.2.1 基因芯片分析实验

先将伤寒沙门菌野生株和mig－14缺陷株分别接种于1mL的低渗的LB液体培养基过夜培养，次日以1：100转种于30mL高渗的LB液体培养基，培养3～4h至对数生长期。然后在冰上放置20min后离心收集菌体，按照QIAGEN RNA提取试剂盒的方法提取细菌总RNA，分析总RNA的质量；再用DNaseI消化痕量的DNA后，在－70℃条件下保存待用。随后按照文献中的方法进行RNA逆转录和cDNA荧光标记、RNA的灭活、cDNA的纯化以及芯片预杂交和数据分析的步骤。

1.2.2 RT－PCR实验

先将伤寒沙门菌野生株和mig－14缺陷株分别接种于1mL的LB液体培养基过夜培养，次日以1：100转种于30mL的LB液体培养基，培养3～4h至对数生长期，然后在冰上放置20min后离心收集菌体，按照QIAGEN RNA提取试剂盒的方法提取细菌总RNA，分析总RNA的质量，再用DNaseI消化痕量的DNA后，在－70℃条件下保存待用，随后按照文献中的方法进行RT－PCR逆转录，将反应体系放PCR仪器上扩增。

2 结果

2.1 基因芯片分析结果

采用GenePix Pro6.0软件，对全基因组芯片分析结果进行图片处理和数据分析，计算每个点杂交后不同荧光物质标记所得信号比值，以log（2）Ratio值描述结果，取－1和1（表达1倍差异）作为阈值。可以看出，mig－14缺陷后受影响的基因较多，但比值普遍较低。

2.2 RT－PCR结果

从基因芯片分析结果表中选择几个基因做实时荧光定量PCR分析，以进一步确证它们受mig－14的影响情况。RT－PCR结果与基因芯片的结果基本一致。

3 讨论

伤寒沙门菌是肠侵染性病原菌，在侵入宿主时会遭受各种环境应激。食物和小肠中的NaCl浓度分别约为50和300mM。在高渗应激早期，我们利用基因芯片技术分析mig－14缺陷株的全基因组表达变化情况，结果发现约140个基因的表达受到mig－14影响。

跨膜的甲基结合性趋化蛋白（MCPs）当感受外界的化学刺激信号时，位于细胞周质空间的MCPs蛋白区域构象发生变化，并将信号通过胞浆中的连接蛋白CheW传递给可溶性的蛋白激酶CheA。CheA自身磷酸化，将磷酸基团转移给反应调节蛋白CheY，磷酸化的CheY结合到鞭毛的传动器蛋白上，使鞭毛由逆时针运动改为顺时针运动。CheR和CheB分别是甲基转移酶和甲基酯酶，前者能将甲基团转移给MCPs，后者促使甲基团与MCPs分离。磷酸化的CheA蛋白能诱导CheB的酶活性。cheZ编码磷酸酶，使CheY－P去磷酸化。MotA和MotB位于膜上，是鞭毛传动器的定子蛋白，能引导质子跨膜运动，质子流动为鞭毛提供旋转动力。

鞭毛是沙门菌的运动器官，也是一种重要的致病因子。约有50个基因与鞭毛的结构和功能相关，按照转录等级关系将这些基因分成3类。它们编码的产物分别是鞭毛装配过程中的早中晚期产物，即：Ⅰ类基因flhDC操纵子是Ⅱ类基因的调节单元，能激活Ⅱ类基因的转录；Ⅱ类基因编码中期产物如鞭毛基底部和弯钩部以及调节子σ28因子（FliA）和σ70因子（FliZ）；Ⅲ类基因主要编码的是鞭毛丝的组成部分以及和鞭毛动力相关的蛋白。属于Ⅲ类基因的有flgN、flgM、flgKL、cheZ、cheY 、cheB、cheR、cheW、cheA、motB、motA、fliC、fliDST。fliAZ与flhDC构成正反馈回路，FliZ先激活flhDC，后者又激活fliAZ。与Ⅱ类基因共表达的FlgM是抗σ28因子，能干扰FliA对Ⅲ类基因的激活表达作用。而在鞭毛基底部和弯钩部装配完成之后，FlgM能通过生长的鞭毛被分泌到胞外，去除对FliA的阻抑作用。flgK、flgL 和 fliD 编 码 HAP1，HAP2and HAP3，它们与FliC蛋白单体输出到胞外及聚合形成鞭毛丝有关。FliS是FliC特异性的伴侣分子，在胞质溶胶中阻碍鞭毛素各亚单位的聚合，能与FliC蛋白C末端无规则区结合，促使FliC蛋白C末端形成稳定的α螺旋结构，有利于FliC输出到胞外。FlgN是Ⅲ型分泌系统的分子伴侣，能与FlgKL相互作用，形成传感装置。当感受到鞭毛装配过程进入中期时，FlgN能阻碍FlgM 的翻译过程，从而释放FliA，促进FliA对Ⅲ类基因的激活作用。FlgT不仅是Ⅱ类基因的负调节因子，也是FliD的分子伴侣，能与FliD结合，防止FliD寡聚化，更有利于FliD从鞭毛特异性的Ⅲ型分泌系统输出。

本次芯片实验结果中除了cheY、motB和fliT没有明显表达变化外，其他Ⅲ类基因和fliAZ在mig－14缺陷株中均表达量下调。因此推测mig－14可能对鞭毛装配的中晚期以及鞭毛的运力有正调控作用。芯片分析结果还显示，在mig－14缺陷株中pagP表达量降低，而ybjX表达量增高，这两个基因菌与细菌拮抗抗菌肽的杀伤作用有关。沙门菌的somA与大肠埃希菌中的ybjX有较高的同源性，沙门菌中也有ybjX基因，其功能未知。SomA蛋白是msbB的抑制因子，因此推测ybjX可能与msbB有相似的作用。

本实验只是通过基因芯片分析，对伤寒沙门菌mig－14基因在高渗应激早期对其他基因表达调控的影响进行了初步探讨，有关mig－14的功能还有待进一步研究。

［1］茅凌翔，朱超望，许化溪，等.伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株的制备［J］.江苏大学学报：医学版，2007，17（2）：145－149.

［2］VALDIVIA R H，S FALKOW.Fluorescence－based isolation of bacterial genes expressed within host cells［J］.Science，1997，277（5334）：2007－2011.

［3］FRASER G M，BENNETT J C Q，HUGHES，C.Substratespecific binding of hook－associated proteins by FlgN and FliT，putative chaperones for flagellum assembly［J］.Mol.Microbiol，1999，32（3）：569－580.