刘 利，胡 勇(综述)，丛延广(审校)

(1.解放军第324医院检验科，重庆400020;2.重庆工学院，重庆400050;3.第三军医大学基础微生物教研室，重庆400038)

病原菌的致病过程是与宿主细胞相互作用的复杂过程，需要许多毒力因子的协调作用。由于病原体在宿主体内所处环境与体外有着明显的不同，为了适应这种环境变化，细菌会通过调节相应的基因表达模式作出适应性反应:即上调在宿主体内存活中起关键作用的基因以及表达感染宿主所必需的基因。由此，有学者提出一个概念，即病原菌在宿主体内表达而在体外不表达的功能基因，称为体内诱导 基 因 (in vivo-induced gene)［1］。大量的研究表明，这些独特的在体内表达而在体外不表达的基因往往对病原体在体内的生存和致病有重要意义。因此，体内诱导基因多数也属于广义的毒力基因范畴，这个广义的毒力基因涵盖了所有有利于致病菌在宿主体内生存和致病的基因，由此带来了很多系统筛选毒力基因的技术方法的提出和改进，包括标记突变技术(signature tagged mutagenesis，STM)、体内表达技术(in vivo expression technology，IVET)、差异荧光诱导技术(differential fluorescence induction，DFI)和体内诱生抗原鉴定技术(in vivo-induced antigen technology，IVIAT)等。现就近年来细菌毒力基因筛选技术的新进展综述如下。

1 STM

STM是近年来提出并完善的一个能高通量地筛选致病菌毒力基因的方法。STM的关键是采用一组突变株(例如96株)同时对模型动物进行感染，同组的每一种突变株都标记了独特的DNA标签。感染一定时间后，如果在相应感染位点或累及组织中分离不出某个突变株，即意味着该突变株是与体内生存和致病过程有关的关键基因发生了突变，成为减毒突变株，它们在宿主体内或者不能生长、繁殖，或者不能有效定植，或者不能侵入组织，或者容易被宿主防御系统清除，从而因为上述种种原因被体内环境所选择掉。通过检测DNA标签，可以确定哪些突变株是减毒突变株，进而确定发生突变的基因。在STM中突变株的构建和DNA标签的标记是用转座子技术同时完成的［2，3］。

STM是一种很强大的毒力基因研究方法，用该法筛选出的突变株，很多是与生存和致病性有关的关键基因发生了突变。因此，通过STM筛选致病菌的毒力基因，不仅有助于对致病机制的研究，由于这些基因对病原菌在宿主体内生存和致病的重要作用，还可用于发展减毒活疫苗、蛋白亚单位疫苗，或作为抗菌药物的作用靶子。自该方法提出后，已成功应用到一些致病菌毒力基因的筛选研究中，包括鼠伤寒沙门菌、布氏杆菌、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌等，还包括一些机会致病菌，如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌等［3-7］。这些研究普遍都筛选到很多减毒突变株，突变基因涉及菌体表面结构、代谢、运输、分泌、压力反应、转录调控以及未知功能。初步研究就发现了一些新的毒力基因，比如涉及霍乱弧菌组织亲嗜性的tcp基因，涉及不同细菌在宿主体内增殖的purlys和trp等基因，以及与逃避抑制宿主防御系统有关的基因等。另外，还有大量减毒突变株突变基因的确切功能还不清楚，从而为后续工作提供了丰富的研究内容。这些研究之所以能够发现很多以前未知的基因，是因为STM作为一个高通量的筛选方法，其筛选范围远远超过了以往的研究策略。

2 IVET

应用IVET首先需要构建一个可以在致病菌中复制的质粒，质粒中携带有无启动子的关键生长因子选择标志和lacZ报告基因。所谓关键生长因子，是指致病菌生长必需的因子，如某种氨基酸。在策略上可以将致病菌合成某种氨基酸的基因突变失活，使之成为营养缺陷株，当其携带的质粒中关键生长因子选择标志的上游插入合适的启动子后，该致病菌的突变株才能在基本培养基中生长以及在宿主中生存繁殖。IVET的基本技术路线包括在egf/lacZ基因前面克隆插入致病菌随机的DNA片段(其中可能包括体内诱导的启动子)，将质粒转入致病菌中;再将致病菌感染动物;从感染动物体内组织分离致病菌(其携带的质粒中一定含有体内诱导表达的启动子，否则无法生长);在平板上进行蓝白筛选，筛选白色菌落(即插入的片段含有的启动子在体外不表达);最后测序和检索，确定具有体内诱导性质的启动子。所以本质上，体内表达技术直接筛选的是具有体内诱导性质的启动子，而体内诱导基因之所以具有体内诱导特点，恰恰是因为其启动子的体内诱导特性，因此通过该方法可以筛选获得致病菌体内诱导基因。IVET同样是一种强大的方法，也已成功应用到一些致病菌毒力基因的筛选研究中，包括鼠伤寒沙门菌、耶尔森菌、铜绿假单胞菌等［8-11］，这些研究也都获得了丰富的结果。

3 DFI

DFI同样采用了启动子陷阱策略，是一种简化了的IVET。该方法采用细胞模型，其技术路线是首先构建一个携带绿色荧光蛋白基因gfp(无启动子)的质粒;在gfp基因前面插入致病菌随机的DNA片段;将质粒转入致病菌;体外培养后，用流式细胞仪筛选出不发荧光的致病菌(即体外不表达);筛选出的致病菌感染宿主细胞;破坏细胞后释放出感染的细菌，用流式细胞仪筛选出发荧光的致病菌(即含有体内表达的启动子);最后通过测序，确定启动子及其调节的体内诱导基因。

与IVET相比，DFI在技术路线上明显简化，不需要构建突变株，另外，通过设置流式细胞仪筛选标准，可以检测在体内上调或下调表达的基因，也适用于测试致病菌在多种条件下的表达情况。但由于只能采用细胞模型，不适用于动物模型的筛选，因此筛选结果不够全面，不能反映致病菌感染的全部环节。但由于操作简便，也获得了广泛应用［12-18］。

4 IVIAT

在前述的体内诱导基因筛选方法中，IVET无疑是最佳的选择。但IVET方法需要动物模型，不适用于没有动物模型的致病菌研究，例如，伤寒沙门菌只对人致病，采用IVET方法就无法进行研究。针对这种情况，最近提出了一种被称为IVIAT的方法为伤寒沙门菌等缺乏动物模型的致病菌的体内诱导基因筛选提供了一种可能。该方法的主要特点是不依赖于动物模型，而是使用实际感染患者的血清来指示病原菌在体内的基因表达情况。其技术路线主要包括:首先利用大肠埃希菌工程菌株(如BL21)构建致病菌的表达文库;然后采用体外培养的大肠埃希菌抗原吸收处理患者的血清;再采用吸收处理后的血清做表达文库克隆的菌落杂交筛选;对阳性克隆进行测序和完整表达复筛［19，20］。

IVIAT法是一种优缺点都很突出的技术。主要的优点包括:不需要动物模型;反映与天然宿主的关系;对病原菌不需要遗传改建;原核、真核病原体都适用;可以检测不同感染阶段的基因表达情况;技术上简单、价格便宜。另外，IVIAT法筛选的体内诱导基因产物有很好的免疫原性，且与细菌致病性有关，为发展伤寒的亚单位疫苗也提供了一种可能。而其主要的缺陷包括:需要患者的血清标本;交叉反应较常见，因此会产生较多假阳性;不能自动化，工作量大等。

上述4种方法特点比较见表1。从表中可以看出4种方法各有优势和独特的技术特点，但是由于病原菌致病过程的复杂性，4种方法并不能完全彼此取代。在实际研究中，有必要根据实际情况进行选择，甚至选择2种以上方法进行研究。

5 结语

病原菌在致病过程中，由于是在一个不利的体内环境中生存、繁殖，要面对宿主防御系统的清除作用，病原菌有必要表达一些独特的基因确保其生存，这些基因往往只在其需要时才进行表达或者上调表达。以往的研究方法在筛选范围和数量上的存在局限性，使得人们对这些基因的认识还不全面。因此以上毒力基因系统筛选方法的建立提供了一个更系统、更完整研究细菌毒力基因的好机会。

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