刘蓉华(综述)，张 雷(审校)

(云南大理学院基础医学院病原生物学综合实验室，云南大理671000)

淋病是目前世界上流行的性传播疾病之一，淋病奈瑟菌为其病原体。据WHO估计，全球每年新发病例超过6000万。由于抗生素的不合理使用，淋病奈瑟菌对其产生了不同程度的耐药性。Ray等［1］报道，在斯里兰卡，淋病奈瑟菌对青霉素的耐药率高达96.8%，8.2%的淋病奈瑟菌耐四环素;在孟加拉，耐青霉素的淋病奈瑟菌达到33%，耐四环素的菌株达到50%，76%的菌株耐环丙沙星。我国各地的淋病奈瑟菌耐药也均有报道，山西大同地区2009年有77%的淋病奈瑟菌耐青霉素，93%耐四环素，而淋病奈瑟菌对环丙沙星100%耐药［2］。广州地区2005～2009年间淋病奈瑟菌对青霉素、四环素、环丙沙星、大观霉素、头孢曲松的耐药率分别为 59.38%、59.38%、66.41%、0.79%、1.56%［3］。新疆地区2007年淋病奈瑟菌对青霉素、头孢曲松、阿奇霉素的耐药率分别为57.1%、28.6%、33.2%［4］。可见，淋病奈瑟菌的耐药现象已十分普遍，淋病奈瑟菌的耐药也成为淋病防治工作中的一大难题。现将近年来淋病奈瑟菌的耐药性及其耐药基因的研究进展综述如下。

1 penA基因和ponA基因突变导致青霉素类耐药

淋病奈瑟菌上的青霉素结合蛋白(penicillinbinding protein，PBPs)是青霉素的主要结合靶点。青霉素含有β-内酰胺，β-内酰胺是通过与PBPs共价结合而阻止细胞壁的合成来杀灭淋病奈瑟菌。Powell等［5］研究表明，淋病奈瑟菌可产生4种分子质量的PBPs:两种高分子质量的A类PBP1和B类PBP2;两种低分子质量的 C类 PBPs:PBP3和PBP4［5］。PBP1和 PBP2是β-内酰胺类抗生素最主要的结合靶位点，尤其是PBP2，染色体介导的淋球菌对青霉素的耐药部分是由于PBP2突变所引起。编码PBP2的基因penA基因出现点突变，在氨基酸排列第345号和第 346号位置中插入一个天冬氨酸(Asp-345a)，同时该蛋白的C末端发生4～6个氨基酸的替换，导致PBP2结构的改变。青霉素作用的另一靶位是PBP1，PBP1是由ponA基因编码的。如果PBP1氨基端第40位氨基酸突变，则淋球菌对青霉素的最低抑菌浓度≥1 g/L，与野生菌株相比，耐药菌株对β-内酰胺类抗生素的敏感性降低［6］。penA基因和ponA基因的突变都会导致其编码的PBPs相应氨基酸序列的改变，使β-内酰胺类抗生素对淋球菌的酰化速度降低，增强淋球菌的耐药性。

2 gyrA基因、parC基因和norm基因的突变引起氟喹诺酮类耐药

淋病奈瑟球菌DNA的复制和重组需要螺旋酶和拓扑异构酶，同时，这两种酶也是淋病奈瑟菌生长所必需的酶。氟喹诺酮类药物可以通过抑制螺旋酶和拓扑异构酶的作用而起到抑菌作用。编码这两种酶的基因发生点突变，形成新的氨基酸，将影响喹诺酮类药物与淋病奈瑟菌上靶位的正常结合，降低了细菌的敏感性，淋病奈瑟菌的耐药性也随之形成［7］。早年国外的研究发现，淋病奈瑟菌对氟喹诺酮类药物的耐药与编码DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ的gyrA基因和parC基因上的一段核苷酸序列的突变有关(DNA旋转酶A亚单位由gyrA基因编码，拓扑异构酶Ⅳ的C亚单位由parC基因编码)，该基因突变位点集中发生在该核苷酸序列N端199～318区间内，该区域称为氟喹诺酮耐药决定区［8］。

廖经忠等［9］对淋球菌喹诺酮类药物作用靶位编码基因gyrA和parC的喹诺酮耐药决定区进行了聚合酶链反应扩增和直接测序分析，分别用氧氟沙星、氟罗沙星、洛美沙星、依诺沙星这4种喹诺酮类抗生素，结果发现淋病奈瑟菌对环丙沙星敏感的淋病奈瑟菌株gyrA基因和parC基因均未发生突变，而中介菌株或耐药菌株均出现gyrA基因突变或同时伴有parC基因突变，并且所有parC基因突变均发生在gyrA基因突变的基础上。gyrA基因发生了Ser91→Tyr、Ser91→Phe、Asp95→Gly、Asp95→Ala、Asp95→Asn等基因的突变，parC基因发生了Gly85→Cys、Asp86→Asn、Ser87→Arg、Ser87→Ile、Ser87→Asn、Ser88→Pro、Glu91→Lys、Glu91→Gly等基因的突变，突变频率最高的为gyrA:Ser91→Phe。与喹诺酮类耐药性相关的淋病奈瑟菌基因还有gyrB和parE等，喹诺酮的高度耐药是由gyrA基因的突变引起，而低度耐药主要是由gyrB基因的突变引起。

Norm系统也参与调节喹诺酮类抗生素的耐药。Norm基因介导的抗生素耐药发生在其启动子235区域，该区域发生的点突变可增强淋病奈瑟菌对喹诺酮类抗生素的耐药性［10］。

3 药物外排机制导致多重抗生素通透性降低

随着抗生素的广泛使用，越来越多的淋病奈瑟菌已不对单一抗生素敏感，出现对多种抗生素同时耐药的现象，即多重耐药性，且有从低水平耐药向高水平耐药发展的趋势。国内外的研究均表明，淋病奈瑟菌的多重耐药性与其多重传递耐药(multiple transferable resistance，MTR)系统的基因突变引起的药物外排机制有关［11］。近年的研究表明，引起淋病奈瑟菌多重耐药的基因主要有mtrR基因和mtrF基因。

mtrR基因系统主要包括mtrR基因和mtrCDE基因。mtrCDE基因位于mtrR基因的下游，主要在转录水平发挥其调节机制。mtrCDE启动子区有一段长度为26 bp的区域，该区域中有mtrR的启动子35区，mtrR与mtrCDE就在该区域结合［12］。mtrCDE编码mtrC基因、mtrD基因和mtrE基因，此三者形成一个完整的三联体结构。mtrR编码一种含有210个氨基酸的阻遏蛋白，该阻遏蛋白能够与mtrC基因上转录启动子结合。mtrR基因的突变可以使其下游的mtrCDE基因的转录开放，mtrCDE基因编码的外膜蛋白复合物增多，外排物质相应增多。淋病奈瑟菌的外排系统是由细胞膜上的脂蛋白在ATP酶的催化下完成的，该主动外排系统能够泵出疏水性的去污剂类、胆盐和脂溶性抗生素等疏水性因子，引起淋病奈瑟菌的耐药性。另有研究表明，淋病奈瑟菌mtrR基因的突变主要表现为3种形式:第45位的Gly(GGC→GAC)Asp、第14位的His(CAC→CGC)Arg和第51位的Phe(TTC→GTC)Val［13］。第45位和第51位的氨基酸位于DNA结合蛋白α-螺旋-转折-α-螺旋的超二级基序的第二个α-螺旋，mtrR基因的突变导致此螺旋的破坏，从而使mtrR与mtrCDE的结合力下降，mtrR基因的阻遏作用减弱，增加了淋病奈瑟菌对抗生素的耐药性［14］。

在mtrR基因的启动子区，有一个13 bp的回文序列，该序列基因的突变也会导致淋病奈瑟菌耐药性的产生。该序列不受mtrR基因的调控，主要突变为形式为 mtrR启动子区 13 bp回文序列 5' AAAAAGTCTTTTT3'的5'端发生了一个T/A碱基的缺失。王东梅等［15］对32株淋病奈瑟菌进行研究，结果发现其中的13株有此突变，可见13 bp回文序列与淋病奈瑟菌的耐药性也有密切关系。

在淋病奈瑟菌的多重耐药性中，mtrF基因也发挥着重要作用。mtrF基因位于mtrR基因下游的22 bp处，与mtrCDE外排泵的关系密切［16］。王冬梅等［15］根据淋病奈瑟菌MIC的不同，用琼脂扩散敏感试验法把32株临床菌种分为敏感组、低中等水平多重耐药组和高度多重耐药组，并用反转录-聚合酶链反应检测3组中mtrF基因的表达情况，结果显示:高度多重耐药组中mtrF基因的表达量明显多于敏感组和低中等水平多重耐药组，推测mtrF基因可能参与淋病奈瑟菌高水平的多重耐药，而mtrR基因只参与淋病奈瑟菌基础水平的多重耐药。mtrF基因介导的淋病奈瑟菌高度多重耐药机制尚待进一步研究。

淋病奈瑟菌对抗生素的外排机制也与淋病奈瑟菌细胞膜上的Far系统有关。Far系统发挥作用需依靠淋病奈瑟菌的外膜通道蛋白mtrE，该系统对长链脂肪酸有耐受性，且该系统受到外膜通道蛋白mtrE的调控［17］。

4 质粒介导耐药与TEM-1基因和tetM基因的关系

淋病奈瑟菌的耐药质粒迄今为止发现有2.6×106的隐蔽性质粒、耐青霉素质粒(2.9×106的里约型、3.5×106的多伦多型、3.2×106的非洲型、4.0×106的尼姆斯型、6.0×106的新西兰型及4.4× 106的亚洲型)、25.2×106的耐四环素质粒和24.5×106的接合型质粒。王德霞等［18］用碱裂解法抽提质粒，对江苏省扬州地区淋病奈瑟菌耐药质粒谱进行研究，并对所抽提质粒分子质量的大小进行测定，结果:含4.4×106的“亚洲型”耐青霉素质粒占73.7%。可见，我国介导质粒耐药的主要为亚洲型。淋病奈瑟菌的耐药质粒可以通过转化和接合两种方式在菌株间传递。淋病奈瑟菌的耐药质粒又称R质粒，能够编码合成破坏抗生素的酶。另有一种为F质粒，它所编码的蛋白质能够使两个细菌间接合，进而传递细菌间的遗传物质。淋病奈瑟菌间的耐药R质粒正是通过F质粒进行传递。

淋病奈瑟菌耐青霉素质粒中含teM-1基因，该基因主要以转座子TnA基因的形式存在于淋病奈瑟菌的耐药质粒中，并通过接合和转化的方式在细菌间传递［19］。teM-1基因可编码 β-内酰胺酶，该酶以β-内酰胺环为底物，使青霉素类抗生素的抗菌作用减弱。25.2×106的耐四环素质粒和24.5×106的结合型质粒可能与介导四环素高水平耐药有关。25.2×106质粒带有tetM决定簇，tetM基因所编码的胞质蛋白能够抑制四环素类药物对细菌核糖体的毒性作用，使淋病奈瑟菌对四环素类药物产生高度耐药［20］。带有该基因的质粒不仅能在淋病奈瑟菌间进行传递，还可以在多种革兰阳性和阴性细菌间传递，从而产生多重耐药和交叉感染［21］。

5 erm基因的出现引起阿奇霉素耐药

近年出现了淋病奈瑟菌对阿奇霉素耐药的现象，其原因可能为erm基因的出现。erm基因编码erm酶，此酶可使rRNA自动甲基化，引起阿奇霉素类抗生素的作用靶位——核糖体50S亚基蛋白发生改变，降低50S亚基蛋白与阿奇霉素类药物的亲和力，导致阿奇霉素类抗生素耐药性的产生［22］。

6 spe位点的突变引起大观霉素耐药

临床上耐大观霉素类淋病奈瑟菌株少见，但近年也出现了淋病奈瑟菌耐大观霉素的报道。研究表明，其耐药机制可能是淋病奈瑟菌染色体上spe位点突变，使其编码的30S核糖体亚单位结构出现改变，从而降低了大观霉素类抗生素与淋病奈瑟菌的亲和力［23］。

综上所述，淋病奈瑟菌对抗生素的耐药情况日益严峻，对青霉素、四环素、喹诺酮等药物已基本上全部耐药，对现今一线药物大观霉素类抗生素也逐渐出现耐药菌株，随着抗生素的广泛使用，耐药情况会越来越严重，因此要加强淋病奈瑟菌耐药性的研究，并根据其耐药机制对淋病奈瑟菌进行针对性处理，如改变淋病奈瑟菌的耐药基因序列，消除耐药质粒;临床上根据耐药机制的不同采取不同的给药措施，如对于penA和ponA改变的菌株，可用喹诺酮类药物进行治疗;对于主动外排机制引起的耐药菌株，可应用能量抑制剂抑制其外排蛋白的主动转运等，以此来降低淋病奈瑟菌耐药性的发生。因此，科研上应着力研究淋病奈瑟菌耐药性产生的机制，尤其是在分子水平上进行研究，以期能够研究出解决淋病奈瑟菌耐药的方法，并为今后抗生素的研制提供合理依据。

［1］ Ray K，Bala M，Kumari S，et al.Antimicrobial resistance of neisseria gonorrhoeae in selected world health organization southeast asia region countries:an overview［J］.Sex Transm Dis，2005，32(3): 178-184.

［2］ 李桢，李玉串，李连青，等.山西大同地区淋病奈瑟菌流行株抗生素敏感性分析［J］.山西医药杂志，2010，39(5):478-479.

［3］ 吴文伟.128株淋球菌药敏分析［J］.吉林医学，2010，31 (9):1213.

［4］ 阴雪涛，郭晨.临床分离1341株细菌的分布和药敏分析［J］.职业与健康，2008，24(17):1853-1855.

［5］ Powell AJ，Tomberg J，Deacon AM，et al.Crystal structures of penicillin-binding protein 2 from penicillin-susceptible and-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae reveal an unexpectedly subtle mechanism for antibiotic resistance［J］.J Biol Chem，2009，284 (2):1202-1212.

［6］ Ropp PA，Hu M，Olesky M，et al.Mutation in ponA，the gene encoding penicillin-binding protein 1，and a novel locus，penC，are required for high-level chromosomally mediated penicillin resistance in Neisseria gonorrhoeae［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46(3):769-777.

［7］ 邹明祥，夏忠弟，陈淑贞，等.淋球菌gyrA和parC基因突变与氟喹诺酮类药物关系的研究［J］.中华皮肤科杂志，2002，35 (3):199-202.

［8］ Tanaka M，Takahashi K，Saika T，et al.Development of fluoroquinolone resistance and mutations involving GyrA and ParC proteins among Neisseria gonorrhoreae isolates in Japan［J］.J Urol，1998，159(6):2215-2219.

［9］ 廖经忠，邹明祥，夏忠弟，等.淋球菌对氟喹诺酮类药物敏感性及其耐药机制的研究［J］.中国现代医学杂志，2009，19(10): 1447-1452.

［10］ Rouquette-Loughlin C，Dunham SA，Kuhn M，et al.The NorM efflux pump of Neisseria gonorrhieae and Neisseria meningitides recognizes antimicrobial cationic compounds［J］.J Bacteriol，2003，185(23):1101-1106.

［11］ 谢国艳，应春妹，周建华.耐氟喹诺酮淋病奈瑟菌基因突变研究［J］.诊断学理论与实践，2006，5(3):243-246.

［12］ 兰宝霞.淋球菌耐药研究进展［J］.河北医学，2010，16(4): 509-511.

［13］ 陈宏翔，涂亚庭，林能兴，等.淋球菌多重耐药性与mtrR基因点突变的关系［J］.华中科技大学学报，2005，34(5):616-618.

［14］ 江山.淋病奈瑟菌多重传递耐药主动外排系统的研究进展［J］.国外医学微生物学分册，2002，25(1):25-27.

［15］ 王冬梅，夏忠弟，齐素文，等.淋球菌IR区基因突变及mtrF表达水平与多重耐药的相关性研究［J］.中国皮肤性病学杂志，2008，22(12):712-714.

［16］ Folster JP，Shafer WM.Regulation of mtrF expression in Neisseria gonorrhoeae and its role in high-level antimicrobial resistance［J］.J Bacteriol，2005，187(11):3713-3720.

［17］ Lee EH，Rouquette-Loughlin C，Folster JP，et al.FarR regulates the farAB-encoded efflux pump of Neisseria gonorrhoeae via an MtrR regulatory mechanism［J］.JBacteriol，2003，185(24): 7145-7152.

［18］ 王德霞，时祝帅，聂青松，等.江苏省扬州地区淋病奈瑟菌耐药性质粒谱的研究［J］.实用临床医学杂志，2008，12(7):75-77

［19］ Thompson DK，Deal CD，Ison CA，et al.A typing system for Neisseria gonorrhoeae based on biotinylated oligonucleotide probes to PIB gene variable regions［J］.J Infect Dis，2000，181(5):1652-1660.

［20］ 张铁军，周晓明，张涛，等.淋球菌分离株耐药质粒谱型研究［J］.中国皮肤性病学杂志，2007，21(3):144-146.

［21］ 夏威为，刘超，陈建国，等.淋病奈瑟菌耐药机制研究进展［J］.河南预防医学杂志，2008，19(5):326-329

［22］ 向丽，张育华，王光西，等.淋球菌耐药基因的研究进展［J］.寄生虫病与感染性疾病，2006，4(2):87-89

［23］ 蒋法兴，其木格，王千秋，等.染色体介导淋球菌耐药机制的进展［J］.国际皮肤性病学杂志，2006，32(5):327-329