莫利求，兰爱平，林 琳，周 舸，张莉莉，杨春涛，王秀玉，杨战利，陈培熹，冯鉴强，

目前，α2肾上腺素受体激动剂(alpha(α)-2-adrenoreceptor agonist)在麻醉及重症监护治疗中的作用日益受到重视。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一种强效的，高度选择性的α2肾上腺素受体激动剂，对人的中枢神经系统具有多种作用，例如临床镇静、轻度的麻醉及镇痛作用等［1－2］。近年的实验研究证明，DEX还有神经保护作用。在剥夺氧气和葡萄糖(模拟缺血)的大鼠海马脑片实验模型，Dahmani等［3］观察到，DEX能减少神经元死亡及凋亡效应器Caspase-3表达，此神经保护作用可能与激活α2肾上腺素受体，继而促进灶性黏附激酶(focal adhesion kinase)的表达有关。然而，DEX能否保护神经细胞对抗化学性缺氧引起的损伤尚未见报道。为此，本文应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理具有神经功能和结构特征的PC12细胞。以建立化学性低氧神经细胞损伤模型，旨在探讨:①DEX能否抑制CoCl2的细胞毒性及致凋亡作用?②DEX能否抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成?③ DEX是否具有线粒体保护作用?通过上述研究为深入阐明DEX的神经保护作用及其机制提供新颖的实验资料。

1 材料与方法

1.1 材料 DEX由江苏恒瑞医药股份有限公司提供。CoCl2，Hoechst33258，DCFH-DA，Rh123购自美国Sigma Aldrich公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo Lab，DMEM高糖培养基购自Gibco公司。

1.2 细胞培养及预处理方法 PC12细胞由中山大学实验动物中心提供，置于含10%新生牛血清的DMEM高糖培养基中，于37℃，5%CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。DEX处理按如下程序实施:400 μmol·L－1DEX 与 600 μmol·L－1CoCl2共同作用PC12细胞24 h。

1.3 细胞存活率的检测 取对数生长期PC12细胞，以 1 ×107·L－1接种于 96 孔板，100 μl/孔。在37℃，5%CO2条件下常规培养过夜后，按实验要求给予不同处理，每孔设8个平行孔，处理完后，每孔加入10 μl的 CCK-8，37℃继续孵育 4 h，用酶标仪(450 nm)记录各孔的吸光度(OD)。取4孔OD值的平均数，按公式计算细胞存活率。细胞存活率/%=处理组OD/对照组OD×100% ，重复3次。

1.4 Hoechst 33258核染色观察凋亡细胞形态和数量 将PC12细胞(1×107·L－1)接种于35mm的小号培养皿中，各实验组按要求给予不同的处理因素后，加入新鲜配置的4%多聚甲醛(pH=7.4)于4℃固定细胞10 min，用 PBS洗2次，加入5 mg·L－1Hoechst 33258染色液染色10 min，用 PBS洗2遍，加入适量的PBS后用荧光显微镜观察，摄片。正常细胞核出现弥散均匀的低密度荧光;细胞核呈固缩形态或颗粒状荧光，计为凋亡细胞。

1.5 细胞内ROS含量的测定 DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可被细胞内的酯酶水解成DCFH，而DCFH不能自由通透细胞膜，从而将探针装载到细胞内。细胞内的ROS可将无荧光的DCFH氧化成发出绿色荧光的DCF，绿色荧光的强弱可以间接反映细胞内ROS水平。将细胞接种于35 mm的培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，倒掉培养液，用无血清的低糖培养液洗两次，随后用10 μmol·L－1DCFH-DA 染液于37℃孵育60 min。在荧光显微镜下随机选取不重复的区域摄片，用Image J 1.41.软件的COLOR Hitogram模块计算出5个视野绿色荧光强度的平均值，再对各组的样本进行统计分析。

1.6 线粒体膜电位(MMP)的检测 Rh123是一种能够被线粒体所吸收的荧光染料，线粒体对其摄取能力取决于其跨膜电位。根据荧光强度可以间接反映MMP的高低，将细胞接种于35 mm的培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，倒掉培养液，用不含血清的低糖培养液洗两次，随后在含100 μg·L－1Rh123的无血清的培养基中37℃孵育45 min，在荧光显微镜下随机选取不重复的区域摄片，细胞核周围的绿色亮点即为摄取了Rh123的线粒体。用Image J 1.41.软件的COLOR Hitogram模块计算出5个视野绿色荧光强度的平均值，再对各组的样本进行统计分析。

1.7 统计学处理 全部实验数据经SPSS 13.0软件进行统计学分析，所有结果以±s表示，组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验，用LSD进行均数之间的比较。

2 结果

2.1 DEX抑制CoCl2诱导的细胞毒性 Fig 1结果显示，600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12 细胞 24 h后，使细胞存活率降低至 39.9% ±2.2%(P＜0.01)，提示CoCl2能产生细胞毒性作用。在600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12细胞的同时，应用100～600 μmol·L－1DEX 作用于细胞能明显的抑制CoCl2的细胞毒性，其中400 μmol·L－1DEX 使细胞存活率升高至(59.3±2.1)%，与CoCl2处理组比较，具有统计学意义(P ＜ 0.01)，400 μmol·L－1DEX本身对细胞存活率无影响。

Fig 1 Effect of dexmedetomidine on cytotoxicity induced by CoCl2＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs CoCl2 group;dexmedetomidine:DEX

Fig 2 CoCl2-induced apoptosis in PC12 cells inhibited by dexmedetomidineAa:Control group，Ab:400 μmol·L －1DEX group，Ac:600 μmol·L－1CoCl2group，Ad:CoCl2+DEX group.##P ＜ 0.01 vs control group，＊＊P ＜0.01 vs CoCl2group.Bar=20 μm.

2.2 DEX抑制CoCl2的致细胞凋亡作用 Fig 2显示 Hoechst33258核染色法检测结果，600 μmol·L－1CoCl2处理PC12细胞48h后，使凋亡细胞数目明显增多，凋亡率达36% ±1.2%。在600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12细胞的同时，应用400 μmol·L－1DEX抑制CoCl2诱导的细胞凋亡作用，使凋亡细胞数目减少，凋亡率降低到22% ±2.2%。400 μmol·L－1DEX本身不引起细胞凋亡。

2.3 DEX抑制CoCl2诱导的ROS过度生成 Fig 3 结果显示，600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12 细胞6h后，使细胞内ROS水平比正常对照组高2.8倍(MFI为 24.7 ±1.4)(P ＜0.01)。在 600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12 细胞同时，应用400 μmol·L－1DEX作用于细胞能抑制CoCl2促进ROS生成作用，使 MFI降低至 15.5 ±2.2(P ＜0.01)。400 μmol·L－1DEX本身对细胞内ROS水平无影响。

Fig 3 CoCl2-induced overproduction of ROS in PC12 cells reduced by dexmedetomidineAa:Control group，Ab:400 μmol·L －1DEX group，Ac:600 μmol·L－1CoCl2group，Ad:CoCl2+DEX group.##P ＜0.01 vs control group，＊＊P ＜0.01 vs CoCl2group.Bar=20 μm.

2.4 DEX抑制CoCl2对线粒体膜电位的损伤作用Fig 4 结果显示，600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12细胞24h后，使细胞内的平均荧光强度(MFI，反映MMP大小的指标)从47.2±2.7(对照组)降到18.5±2.2(P＜0.01)，提示 CoCl2能损伤线粒体，使MMP 降低。然而，在 600 μmol·L－1CoCl2处理PC12细胞同时，应用 400 μmol·L－1DEX 作用细胞，能阻断CoCl2降低 MMP的作用，MFI升高至34.5±2.1(P＜0.01)。

Fig 4 Inhibitory effect of CoCl2on MMP in PC12 cells block by dexmedetomidineAa:Control group，Ab:400 μmol·L －1DEX group，Ac:600 μmol·L－1CoCl2group，Ad:CoCl2+DEX group.##P ＜ 0.01 vs control group，＊＊P ＜0.01 vs CoCl2group.DEX，Bar=10 μm.

3 讨论

CoCl2是一种化学性低氧模拟剂，在不同的细胞能模拟低氧/缺氧性损伤，表现为促进活性氧(ROS)生成［4－5］，降低线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)［4，6］，并引起细胞毒性和细胞凋亡［4－7］。因此，本文应用 CoCl2处理具有神经元结构和功能特征的PC12细胞，以探讨α2肾上腺素受体激动剂DEX能否保护PC12细胞对抗化学性低氧引起的损伤。

本文证实，在 100 ～ 600 μmol·L－1浓度范围内，DEX能浓度依赖性地抑制CoCl2引起的细胞毒性，使PC12细胞存活率明显提高。同时，我们也注意到 50 μmol·L－1或 800 μmol·L－1DEX 虽然也能提高PC12细胞的存活率，但与对照组比较，差异不具有统计学意义(P＞0.05)，这提示DEX的抗细胞毒性作用存在一定浓度范围，浓度偏低或过高可能会影响其细胞保护作用，其有关机制尚需进一步的研究。另一方面，DEX也能抑制CoCl2的致细胞凋亡作用，使细胞凋亡数量减少。上述结果提示，DEX能保护神经细胞对抗化学性低氧引起的损伤。最近Jean等［8］报道，应用DEX预处理或后处理(postconditioning)小鼠海马脑片后能保护海马神经元对抗缺血损伤，这与本文的结果相吻合，并提示DEX可在不同的缺氧或缺血细胞实验模型中发挥其神经保护作用。

为了进一步探讨DEX保护PC12细胞对抗化学性低氧引起的损伤的作用机制，本文观察了DEX对CoCl2诱导的ROS过度生成的作用。ROS(包括超氧阴离子、H2O2等)被认为是缺氧/缺血性损伤的一个重要因素。ROS可快速地影响膜脂质、酶及其它重要的细胞成分，从而导致细胞死亡。ROS也可通过线粒体-ATP敏感性钾通道及线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)等途径损伤线粒体功能［9］。本文证实，DEX能明显的抑制CoCl2诱导的ROS过度生成，提示DEX具有抗氧化应激作用，抑制ROS过度生成可能是DEX的神经保护机制之一。本实验组在另一实验中应用ROS抑制剂NAC后也能抑制CoCl2诱导的损伤，进一步证实了这一推断。

本文还观察到 DEX能明显地对抗 CoCl2对MMP的损伤作用，使MMP丢失减小。MMP的稳定是产生ATP及维持细胞内稳态所必需的，是影响细胞生存的一个重要因素［10］。因此，本文推测，对抗CoCl2对MMP的降低作用可能是DEX另一神经保护机制。

［1］Jalowiecki P，Rundner R，Gonciarz M，et al.Sole use of dexmedetomidine has limited utility for conscious sedation during outpatientcolonoscopy［J］.Anesthesiology，2005，103:269 －73.

［2］Walker S M，Howard R F，Keay K A，et al.Developmental age influences the effect of epidural dexmedetomidine on inflammatory hyperalgesia in rat pups［J］.Anesthesiology，2005，102(6):1226－34.

［3］Dahmani S，Rouelle D，Gressens P，Mantz J.Effects of dexmedetomidine on hippocampal focal adhesion kinase tyrosine phosphorylation in physiologic and ischemic conditions［J］.Anesthesiology，2005，103(5):969 －77.

［4］孟金兰，兰爱平，杨春涛，等.热休克蛋白90在硫化氢保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤中的作用［J］.中国药理学通报，2010，26(1):103 －7.

［4］Meng J L，Lan A P，Yang C T，et al.Role of heat shock protein 90 in protective effect of hydrogen sulfide against PC12 cells injuries induced by chemical hypoxia［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):103－7.

［5］Jung J Y，Mo H C，Yang K H，et al.Inhibition by epigallocatechin gallate of CoCl2-induced apoptosis in rat PC12 cells［J］.Life Sci，2007，80(15):1355 －63.

［6］兰爱平，梅卫义，孟金兰，等.硫化氢通过抑制p38 MAPK保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤［J］.中国药理学通报，2010，26(10):1339－43.

［6］Lan A P，Mei W Y，Meng J L，et al.Hydrogen sulfide protects PC12 cells against chemical hypoxia-induced injury by inhibing p38MAPK［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(10):1339 － 43.

［7］Zou W，Yan M，Xu W，et al.Cobalt chloride induces PC12 cells apoptosis through reactive oxygen species and accompanied by AP-1 activation［J］.J Neurosci Res，2001，64:646 －53.

［8］Dahmani S，Rouelle D，Gressens P，et al.Characterization of the postconditioning effect of dexmedetomidine in mouse organotypic hippocampal slice cultures exposed to oxygen and glucose deprivation［J］.Anesthesiology，2010，112:373 －83.

［9］Crompton M.The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death［J］.Biochem J，1999，341:233 －49.

［10］Akao M，O’Rourke B，Teshima Y，et al，Mechanistically distinct steps in the mitochondrial death pathway triggered by oxidative stress in cardiac myocytes［J］.Circ Res，2003，92:186 －94.