禹峰 步雪峰 李华 张拥军 王春友 崔静

·论著·

整合素β1基因沉默对胰腺癌细胞PANC1体外侵袭能力的影响及机制研究

禹峰 步雪峰 李华 张拥军 王春友 崔静

目的应用短发夹RNA(shRNA)沉默人胰腺癌细胞株PANC1的整合素β1(integrinβ1)基因表达，观察其对PNAC1细胞体外侵袭能力的影响，探讨其机制。方法构建靶向integrinβ1基因的shRNA真核表达质粒integrinβ1-shRNA及对照真核表达质粒c-shRNA，转染人胰腺癌PANC1细胞，以未转染质粒的细胞作为对照组。应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测integrinβ1、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平，应用Transwell侵袭小室检测细胞体外侵袭能力。结果integrinβ1-shRNA组、c-shRNA组和对照组细胞integrinβ1 mRNA表达量分别为0.0029±0.0004、0.0131±0.0009、0.0138±0.0005； integrinβ1蛋白表达量为0.0159±0.0062、0.3215±0.0126、0.3107±0.0094。integrinβ1-shRNA组integrinβ1 mRNA和蛋白表达抑制率分别为(78.6±7.2)%和(92.9±3.2)%(P<0.01)。而c-shRNA组与对照组差异无统计学意义(P=0.2999)。integrinβ1-shRNA组穿膜细胞数由(52±5)个降低至(21±4)个(P<0.01)；MMP-2和MMP-9 mRNA表达分别从0.592±0.073和0.847±0.069降低到0.102±0.034和0.273±0.071；MMP-2和MMP-9蛋白表达分别从0.225±0.046和0.416±0.081降低到0.059±0.013和0.106±0.022(P值均<0.05)。结论重组质粒integrinβ1-shRNA能有效地抑制PANC1细胞integrinβ1基因的表达，并可能通过下调MMP-2和MMP-9基因表达而抑制其体外侵袭能力。

胰腺肿瘤； 整合素β1； shRNA； 肿瘤侵润

胰腺癌早期发生局部播散和远处转移是影响预后的主要因素[1]。整合素β1(integrinβ1)是细胞黏附分子家族中的一员，在细胞间、细胞与细胞外基质间的黏附及信息传递中起到重要作用。近年研究发现，肿瘤细胞内integrin β1表达上调是影响肿瘤侵袭转移表型的分子学改变之一[1]。本实验构建靶向integrinβ1的shRNA真核表达质粒，观察其转染胰腺癌PANC1细胞后对细胞体外侵袭能力的影响，探讨其作用机制。

材料和方法

一、重组质粒构建与鉴定

真核表达质粒载体pGC-silencer-CRM30购于上海吉凯公司，含CMV启动子，编码GFP报告基因和neo抗性基因。靶向integrinβ1(NM_004763.3)的shRNA序列为5′-ATGGGACACGGGTGAAAATTT-3′(572-592)，携带GFP的对照shRNA(c-shRNA)序列为5′-CTTACGCTGAGTACTTCGA-3′，均由上海吉凯公司合成。单链DNA片段经95℃退火5 min形成互补双链DNA，应用T4DNA连接酶(Promeg公司)连接至经BamHⅠ和Hind Ⅲ(TaKaRa公司)双酶切线性化的pGC-silencer-CRM30，转化感受态DH-5大肠杆菌，通过卡那霉素筛选扩增。……