银杏愈伤组织诱导初步研究

2011-11-21张威威秦公伟程水源

长江大学学报(自科版) 2011年3期

张威威秦公伟程水源许锋

(长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025) (陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723000) (黄冈师范学院生命科学与工程学院，湖北黄冈 438000) (长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025)

银杏愈伤组织诱导初步研究

张威威秦公伟程水源许锋

以银杏(Ginkgobiloba)的嫩叶为外植体，以MS为基本培养基，探讨了6-BA、KT及NAA不同配比组合在愈伤组织诱导中的作用。结果表明，MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L培养基诱导的银杏愈伤组织生长量多，呈浅黄绿色、颗粒化明显、排列疏松，效果较好。

银杏(Ginkgobiloba)；培养基；愈伤组织

银杏(Ginkgobiloba)是现有种子植物中最古老的孑遗植物，又称“活化石”。银杏寿命长，又名“公孙树”。它原产中国，具有极高的经济、生态、观赏和科研价值，尤其是银杏体内化学物质黄酮、帖内酯的药用价值[1]，已受到世界范围内研究者日益广泛的关注。

通过组织培养获取大量细胞，从中提取黄酮、银杏帖内酯等药用成分，不仅可以人为控制培养条件，选择优良细胞系得到较高含量的代谢产物，还具有速度快，周期短，效率高等特点。上世纪30年代以来，国内外学者先后开展了银杏配子体、胚、叶片、茎段等外植体培养研究。各种外植体在一定条件下已诱导出愈伤组织，但有关影响银杏愈伤组织培养因子研究报道较少[2，3]。本研究通过对培养基、激素种类和浓度等培养条件进行了初步探讨，以期寻求一种适合银杏愈伤组织诱导的方法，为银杏生物技术研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

银杏叶采自长江大学银杏科技园，银杏品种为10年生家佛手，树势良好，生长正常。

1.2方法

(1)愈伤诱导培养基的筛选采用的培养基为：①MS+NAA 2 mg/L+KT 1 mg/L；②MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L；③MS+NAA 2 mg/L+6-BA 1 mg/L。

(2)愈伤组织诱导将刚采集的银杏嫩叶先用自来水冲洗干净，经蒸馏水漂洗，装入广口瓶放入超净工作台，加入体积分数为75%的乙醇溶液灭菌约10 s，倾倒掉乙醇后，材料转入质量分数0.1%的升汞溶液中消毒8～10 min，完成后立即用无菌水冲洗3～4次[4,5]。夹取嫩叶，在灭菌培养皿内无菌滤纸上，将材料切分成3～5 mm的小块，分别接种在准备好的培养基上；每瓶接种4块，每种培养基接种60瓶。

(3)培养条件每天光照12 h左右，光照强度2 000 lx，温度控制在(28±1)℃，相对湿度60%～75%。

(4)指标计算方法分别按下述公式计算成活率、污染率、死亡率和愈伤组织诱导率。

成活率(%)=(未污染未坏死外植体数/接种外植体个数)×100%；

污染率(%)=(污染外植体数/接种外植体个数)×100%；

死亡率(%)=(坏死外植体数/接种外植体个数)×100%；

愈伤组织诱导率(%)=(再生愈伤团数/接种外植体个数)×100%。

2 结果与分析

2.1培养基接种效果

外植体接种到培养基上，在设定的培养条件下光照培养。一周左右长出愈伤组织，数量不断增多，体积膨大，颗粒化逐渐出现。培养基接种后生长状况统计结果见表1。

表1 培养基接种效果

2.2愈伤诱导培养基的筛选

将银杏嫩叶消毒后接种在三种愈伤组织诱导培养基上光照培养。银杏嫩叶所诱导的愈伤组织的生长周期约为30 d左右，其生长延缓期约为10 d，第10至25 d为快速生长期，25 d后进入稳定期，稳定期过后，愈伤组织很快衰老，变褐死亡。在愈伤组织诱导培养基的筛选试验中，图1是在接种后第15 d的愈伤组织生长效果。

从图1中可知，①号培养基诱导的愈伤组织淡绿色、生长量少、颗粒化不很明显；②号培养基诱导的愈伤组织浅黄绿色、生长量多、颗粒化明显、排列疏松；③号培养基诱导的愈伤组织绿色、生长量多、颗粒化不明显、排列紧密。结果表明，在相同种类水平生长素(NAA 2 mg/L)，相同种类较低水平细胞分裂素(KT ①号培养基1 mg/L，②号培养基0.1 mg/L)有利于愈伤组织生长，颗粒化；不同种类相同水平细胞分裂素(①号培养基KT 1 mg/L，③号培养基6-BA 1 mg/L)，6-BA有利于愈伤组织生长，但颗粒化不明显，细胞排列密实；综合比较三种培养基上愈伤组织生长状况，②号培养基MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L比较适合银杏嫩叶愈伤组织的诱导，所得愈伤组织相对较好，适合进一步后期的继代培养或者细胞悬浮培养研究。

图1 不同培养基诱导的愈伤组织

3 讨论与小结

植物生长所需要的培养基成分包括碳源、大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和植物生长调节剂。因各种植物对营养成分的需要不同，培养基中各组分的浓度和不同组合，将对植物的生长产生不同的影响。为了选择银杏愈伤组织诱导生长的最适培养基，本试验参考于荣敏等[6]、晓原等[7]和杨林等[8]的研究结果，在以往的研究基础上，进一步分析了6-BA、KT、及NAA三种激素不同配比组合在愈伤组织诱导中的作用；通过培养基的筛选诱导愈伤组织，获得了生长速度快、颗粒化好、疏松的愈伤组织，得到的银杏嫩叶愈伤组织诱导最适培养基为MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L，与于荣敏等[6]的研究结果相近。

[1]庞允，杨建秀，刘子兰.银杏叶中黄酮的提取工艺比较[J].制剂技术，2007，16(3)：38～39.

[2]Tulecke W R. A tissue derived from the pollen ofGinkgobiloba[J]. Science. 1953，117: 559～600.

[3]罗紫娟.银杳组织培养的韧步研究[J].云南植物研究，1984，6(1)：93～97.

[4]王德强，王晓玲.银杏细胞的悬浮培养研究[J].食品与生物技术学报，2005，24(3)：27～29.

[5]郭勇，崔堂兵，谢秀祯.植物细胞培养技术与应用[M].北京：化学工业出版社，2004.7.

[6]于荣敏，赵鸿莲，张辉，等.银杏细胞悬浮培养及其银杏内酯产生的研究[J].生物工程学报，1999，15(2)：207～210.

[7]晓原，曹有龙.外部因子条件对麻黄细胞悬浮培养的影响[J].宁夏农学院学报，2001，22(3)：48～52.

[8]杨林，周吉源.银杏细胞悬浮培养及黄酮的产生[J].中央民族大学学报(自然科学版)，2002，11(1)：55～58.

10.3969/j.issn.1673-1409.2011.01.085

Q813.1;Q949.64

1673-1409(2011)01-0237-03

2010-09-21