漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理未漂浆提高抗菌性能的研究

2011-11-21裴继诚于秀玲张方东

中国造纸 2011年9期

关键词：纸样丁酯苯甲酸

裴继诚于秀玲张方东

(天津科技大学天津市制浆造纸重点实验室，天津，300457)

漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理未漂浆提高抗菌性能的研究

裴继诚于秀玲张方东

(天津科技大学天津市制浆造纸重点实验室，天津，300457)

从提高纸张抗菌性能角度出发，研究了漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理未漂硫酸盐浆后纸样抗菌性能的变化。结果表明，漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理未漂硫酸盐浆抄造的纸样能较好地抑制细菌的生长，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌率分别为94.50%、90.87%、98.99%和99.12%。耐洗实验结果表明，纸样经4次洗脱后其抑菌率变化不大，推测对羟基苯甲酸丁酯在漆酶作用下与纤维发生化学键连接而非简单的物理吸附。通过浆料卡伯值的测定和扫描电镜的检测结果间接表明了对羟基苯甲酸丁酯在漆酶的作用下可以接枝到纤维表面，表现为卡伯值增加，纤维表面有沉积物及纤维间生成连接膜。

漆酶;对羟基苯甲酸丁酯;未漂硫酸盐浆;抗菌活性

近年来，受健康消费理念的影响，人们越来越重视产品是否具有抗菌性能［1］，尤其在食品行业，采用抗菌纸包装食品，从而最大限度降低防腐剂的用量，这引起广泛关注［2］。生活中大部分的抗菌纸是在纸张生产过程中，通过湿部添加、表面施胶、喷淋、浸渍、涂布抗菌剂等方式制得，使其获得抗菌性［3］。然而湿部添加、浸渍、涂布等方式存在着涂布量不均、抗菌剂易溶出扩散等缺陷。

酚类物质作为有机抗菌剂的一种，可以作为自由基吸收剂而起到抗氧化作用。已有研究表明，一些天然物中提取的酚类物质可以较好地抵制微生物的生长［4-5］。漆酶是一种含铜多酚氧化酶，可催化氧化多种酚类及芳香胺底物，进而赋予纤维一些特性［6］。近几年来，一些学者对漆酶/酚类物质改善植物纤维性能进行了初步探讨。Fillat A等人［7］应用漆酶/对香豆酸对丙酮抽提后的麻浆进行处理可有效地改善纤维的性能。G Elegir等人［8］对未漂硫酸盐浆的手抄片(定量140 g/m2)进行漆酶/丁香酚处理，研究结果表明，漆酶能有效地催化氧化丁香酚，并赋予纸张良好的抗菌性能。

对羟基苯甲酸酯是有效的防腐剂和抑菌剂，可用于食品、医药等行业［9］。本实验利用对羟基苯甲酸丁酯良好的抑菌性能，研究漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理未漂硫酸盐浆后纸样的抗菌效果，并对其抗菌机理进行初步探讨，为漆酶/酚类物质处理后的抗菌纸样在食品行业的应用提供一定的理论依据。

1 实验

1.1 原料

未漂硫酸盐浆:金星牌商品浆;漆酶:由Novozymes A/S提供，商品名NOVOZYM-51003，酶活1070 U/g;对羟基苯甲酸丁酯购于Sigma-Aldrich化学公司;实验菌种:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌由天津科技大学食品科学与工程学院提供。

1.2 仪器

1107型浆料疏解器，瑞典Lorentzen＆Wettre Co.Ltd制造;P40110 E000型PFI磨，奥地利PTI有限公司制造;900428型快速纸页成形器，德国ESTANIT GmbH制造;SEM X-300扫描电子显微镜，Philips FEI QUANTA 200制造;HNY-100B恒温培养振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司制造。

1.3 方法

1.3.1 对羟基苯甲酸丁酯的抑菌效果

采用牛津杯法检测对羟基苯甲酸丁酯的抑菌能力。首先取菌浓为105～106CFU/mL的指示菌培养物0.1 mL滴加到平板 (直径为90 mm)上，采用涂布棒将平板均匀涂满，自然干燥30 min，然后将牛津杯均匀放置在平板上，每个平板放1个，最后向其中加入待测液0.2 mL(待测酚类物质浓度为0.015 g/mL)，37℃培养24 h，测定抑菌圈直径。每个样品做3次重复实验，结果取平均值。

1.3.2 浆料的处理

未漂硫酸盐浆经去离子水浸泡、疏解后，采用PFI磨打浆至45°SR，备用。

漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理:取4 g绝干未漂硫酸盐浆，稀释至浆浓4%，调解浆料pH值为5，加入预先用乙醇溶解的对羟基苯甲酸丁酯 (添加量为绝干浆的3.5%)，通空气充分搅拌5 min后加入漆酶 (18 U/g)，置于温度已达到50℃的恒温摇床内，以100 r/min处理4 h。

对照样:单独漆酶处理及单独对羟基苯甲酸丁酯处理，其他处理条件不变。

1.3.3 纸样抗菌性能的检测

采用改良奎因法检测纸张的抑菌效果［10］。将指示菌配成105～106CFU/mL的菌悬浮液，备用。将纸张裁成大小为25 mm×25 mm的纸片放入直径为90 mm的无菌培养皿内，均匀滴加0.5 mL菌液置于37℃培养箱内干燥1 h，干燥后的纸片平贴于营养琼脂平板表面，再用半固体营养琼脂均匀覆盖纸样表面，置37℃培养箱内培养48 h，每个样品做6次重复实验。采用活菌计数法测定其活菌数，计算见式 (1)。

式中，K为活菌数;A为从空白样回收的平均菌数;B为从抗菌纸样回收的平均菌数。

1.3.4 纸样溶出类型的判定及纸样耐洗实验［11］

依据纺织行业标准 FZ/T73023附录E和GB8629—2001分别对纸样进行溶出性评价及耐洗测试。

1.3.5 卡伯值测定

根据GB/T1546—2004方法测定处理前后未漂硫酸盐浆的卡伯值。

1.3.6 扫描电镜观察

将纸样裁成一定大小喷金后，在扫描电镜上观察并照相，加速电压为20 kV。

2 结果与讨论

2.1 对羟基苯甲酸丁酯的抑菌效果

采用二甲基亚砜溶解对羟基苯甲酸丁酯，溶液浓度为0.015 g/mL。取0.2 mL对羟基苯甲酸丁酯溶液滴加到牛津杯中，37℃培养24 h，其抑菌效果以抑菌圈直径为标准，抑菌活性3次重复实验差异不显著(P≤0.05)，抑菌效果如表1所示。由表1可知，对照样二甲基亚砜的抑菌圈直径为0 mm，说明其本身无抑菌效果，而对羟基苯甲酸丁酯对各实验菌抑菌圈直径在20.0～25.0 mm，表明对羟基苯甲酸丁酯具有良好的抑菌活性。

表1 对羟基苯甲酸丁酯抑菌效果

2.2 纸样抗菌性能分析

牛津杯法适用于检测溶出类型产品的抗菌性能，本实验中纸张属于非溶出型，因此采用改良奎因法检测不同处理方式后纸样的抑菌效果，3次重复实验差异不显著 (P≤0.05)，实验结果见表2。

表2 不同方式处理浆料所得纸样的抑菌率 %

与空白样相比，单独漆酶处理的纸样无抑菌效果。添加对羟基苯甲酸丁酯及漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理后的纸样均具有不同程度的抑菌效果，漆酶/对羟基苯甲酸丁酯的抑菌趋势与对羟基苯甲酸丁酯抑菌趋势基本相同，漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理的纸样对实验菌种的抑菌效果更佳，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌的抑菌率分别为94.99%、98.99%、90.87%和99.12%。对羟基苯甲酸丁酯本身对大肠杆菌、沙门氏菌具有较好的抑菌效果，而经漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理后的纸样对大肠杆菌、沙门氏菌抑菌率几乎达100%，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌同样具有良好的抑菌性能。

2.3 纸样的溶出类型评价及耐洗性测试

纸样抑菌实验结果表明，单独添加对羟基苯甲酸丁酯处理的纸样也具有抗菌性，为了验证对羟基苯甲酸丁酯与浆料中的纤维是否发生化学连接，对单独添加对羟基苯甲酸丁酯处理的纸样及漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理的纸样进行溶出性测试及耐洗实验。

表3 不同处理方式纸样溶出性评价

表3为纸样对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的溶出性评价。从表3中可以看出，与空白样相比，添加漆酶/对羟基苯甲酸丁酯的纸张对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌带宽均＜1.0 mm，而仅添加对羟基苯甲酸丁酯处理的纸样抑菌带＞1.0 mm。参考FZ/T73023—2006附录E判断:漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理纸样属于非溶出型，单独对羟基苯甲酸丁酯处理纸样属于溶出型。推测认为，单独添加对羟基苯甲酸丁酯处理浆料，由于对羟基苯甲酸丁酯的水溶性较差，处理过程中一部分在抄片过程中流失，另一部分与纤维间发生物理吸附;而对羟基苯甲酸丁酯在漆酶催化下，与纤维发生了化学键连接，几乎无溶出。

对不同处理方式的纸样进行耐洗实验并进行抑菌测试，重复实验差异不显著 (P≤0.05)，结果见表4。实验结果表明，漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理所得纸样随着洗脱次数的增加，抑菌率变化很小，经4次耐洗实验后，纸样抑菌率降低7%左右;而仅用对羟基苯甲酸丁酯处理纸样随洗脱次数的增加抑菌率显著降低。这进一步说明，在漆酶的催化氧化作用下对羟基苯甲酸丁酯与纤维之间发生了化学作用，而不是简单的物理吸附，处理后纸样具有良好的耐洗性，其抑菌率随洗涤次数增加变化不大。

表4 不同处理方式纸样多次洗脱后的抑菌率 %

2.4 卡伯值测定及扫描电镜分析

前面的实验表明，漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理未漂硫酸盐浆可以有效提高纸样的抗菌性能，通过纸样溶出性评价及耐洗性测试结果推测对羟基苯甲酸丁酯在漆酶催化氧化作用下与纤维产生了化学键连接。为了更深入地研究对羟基苯甲酸丁酯对纸张抗菌性能的影响，对处理浆料的卡伯值及不同处理方式的纸样的表面形貌进行了分析，分别见表5和图1。

表5表明，单独使用漆酶处理浆料卡伯值略有降低，而使用漆酶/对羟基苯甲酸丁酯体系处理浆料的卡伯值提高了6.13%。推测纤维卡伯值增加的可能原因是由于浆料中添加对羟基苯甲酸丁酯后，对羟基苯甲酸丁酯在漆酶的作用下与纸浆中木素产生了连接，进而提高浆料卡伯值。Fillat A等人［7］的实验也表明，漆酶/酚类化合物处理未漂化学浆，其卡伯值有所提高。

图1 不同处理方式所得纸样扫描电镜图

表5 浆料处理前后卡伯值变化

扫描电镜分析发现，漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理可以对纤维表面进行有效地改性。图1(a)为未经漆酶处理的空白纸样，纤维表面光滑、平整，纤维之间只是简单地相互交织在一起;单独使用漆酶处理的纸样见图1(b)，部分纤维表面变得粗糙并产生“自黏合”;采用漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理的纸样见图1(c)，纤维表面更加粗糙，并且可以观察到纤维表面有沉积物及纤维间相互“黏结”，出现大面积的纤维“融结”现象。其原因可能是采用漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理纸浆的过程中，对羟基苯甲酸丁酯被催化氧化后与木素发生了化学键连接。

由上述分析结果可以推测，对羟基苯甲酸丁酯本身具有良好的抵制细菌生长的能力，被漆酶催化氧化后与纤维以一定的方式结合而非简单的物理吸附，同时保留了其抗菌基团，进而提高了纸张的抗菌性能。

3 结论

3.1 对羟基苯甲酸丁酯与漆酶协同作用处理未漂硫酸盐浆，与空白样相比，所得纸样经改良奎因法检测具有较好的抑制微生物生长的能力，抑菌趋势与对羟基苯甲酸丁酯抑菌效果基本相符。

3.2 纸样溶出性评价及耐洗实验间接证明了对羟基苯甲酸丁酯在漆酶的催化氧化作用下能够沉积到纤维上，与纤维表面木素形成化学键连接，从而赋予纸张良好的抗菌特性。

3.3 漆酶/对羟基苯甲酸丁酯处理后的浆样与空白浆样相比卡伯值显著增加。通过扫描电镜分析，纤维间相互“黏结”，有膜状物和沉淀物生成。

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Improving the Antimicrobial Activity of Unbleached Kraft Pulp by Treatment with Laccase and Butyl 4-Hydroxybenzoate

PEI Ji-cheng*YU Xiu-ling ZHANG Fang-dong
(Tianjin Key Lab of Pulp＆ Paper，Tianjin University of Science＆ Technology，Tianjin，300457)
(*E-mail:jcpei@tust edu cn)

In order to improve the antimicrobial activity of paper，the antimicrobial activity of the paper manufactured with the kraft pulp which was treated with laccase/buty1 4-hydroxybenzoate was evaluated．The experimental results showed that，the handsheet paper containing laccase and butyl 4-hydroxybenzoate showed a greater efficiency against the growth of bacteria，which resisted s．aureus，bacillus subtilis，e．coli，salmonella to 94．50%，90．87%，98．99%，and 99．12%respectively．There was little change of anti-bacteria effect of the handsheet paper after washing four times，which indicated that the chemical bonds between butyl 4-hydroxybenzoate and fibers probably were formed in the presence of laccase．After the enzymatic treatment，kappa number increase compared with the control sample，and the observation of scanning electron microscope(SEM)indicated that fibers treated by laccase and butyl 4-hydroxybenzoate were agglutinated together in wide area，which indicated that the phenol compounds may be linked to the surface of fibers by covalent bond to some extent．

lacccase;butyl 4-hydroxybenzoate;unbleached kraft pulp;antimicrobial activity