五莲黑猪IFN-γ基因克隆、序列分析及同源建模研究

王海洲 （山东省日照市畜牧站 276800） 丁永贵 （山东省平邑县畜牧兽医局）贾晓晖 （山东省日照市畜牧兽医局）

从GenBank/DDBJ/EMBL基因库中读取猪IFN-γ基因进行序列分析设计引物，基因组中克隆了IFN-γ基因序列并分析其基因组结构，运用生物信息学技术对测序结果进行分析，同源建模分析，发现该基因由氨基末端结构域和羧基末端结构域构成。

五莲黑猪 IFN-γ 基因组 同源建模

五莲黑猪属华北型猪，是山东省地方良种，该品种毛色纯黑、适应性强、耐粗饲、肉质优良、肉味鲜美、抗病力强生长速度快、产仔数高等特点，深受日照市五莲县及鲁南地区群众的喜爱，一度成为当地的当家品种，经济杂交优势明显，是生产瘦肉猪的良好母本。随着猪肉生产日益向着瘦肉方向的发展，瘦肉率与肉质间的负相关所造成的不利影响也明显地表现出来。据报导瘦肉率较高的品种或品系，应激敏感猪(PSS猪)较多，PSE(pale, soft&exudative)肉和DFD(dark, firm&dry)肉的发生率也较高，因而导致了猪肉品质的下降，严重地影响了肉的食用价值和经济价值，鉴于国外这种情况，研究和发掘我国地方品种，对于改良生猪性能具有重要的意义。

猪干扰素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)是一种具有强烈抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由激活的T细胞和NK细胞产生，在机体免疫系统中发挥重要作用[1,2]。研究证实，IFN-γ作为生物药剂或疫苗佐剂具有安全、高效、无毒副作用等特点[3,4]。1990年Dijikmans等[5]首先克隆了含内含子的猪IFN-γ基因。随后，Vandenbroeck等[6]又分段克隆了猪IFN-γ基因的外显子并将其拼接为完整基因后进行了原核表达。此后不断有关于猪IFN-γ基因克隆和表达的报道[7,8]。为了研究和开发新型的疫苗佐剂和相关生物制剂，有效控制一些严重危害养猪业的传染病，本研究通过对猪外周血单个核细胞(PBMC)刺激诱导后，采用反转录-聚合酶链(RT-PCR)技术克隆了猪IFN-γ基因，并对其序列进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1 试剂盒及试剂

1.1.1 菌株和质粒 转化态受体菌株为DH5α由本实验室保存，克隆载体为pMD-18T，购自Takara公司；

1.1.2 试验动物 50周龄五莲黑猪10头由日照港物业有限公司五莲黑猪保种基地提供；

1.1.3 引物设计 登录GenBank数据库，根据登录的猪(NM_214078.1)的IFN-γ基因序列，在其阅读框外侧用Oligo软件设计引物：上游引物5′-TCTCTCCGAAACAAT GAGTTA-3′，下游引物5′-TAATAGATACCCATTTTCATC ACA-3′，上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.1.4 工具酶及试剂 RNA提取试剂盒、dNTP、LA-Taq酶、AMV反转录酶、DNA MakerDL2000、质粒纯化试剂盒购自Takara生物公司；琼脂糖、RNasin、氨苄青霉素、X-gal、IPTG购自华美生物工程公司；T4连接酶购自TOY-OBO生物公司；胰蛋白胨、酵母提取物为OXID产品。

1.2 五莲黑猪IFN-γ基因克隆与鉴定

1.2.1 总RNA的提取 取冻存的五莲黑猪肝脏组织在液氮中充分研磨，在液氮挥发完全之前用总RNA 抽提试剂盒，按照试剂盒操作手册进行总RNA的提取。用日本岛津生物仪器公司的DNA/RNA计算器和甲醛凝胶电泳检测RNA 质量。

1.2.2 五莲黑猪IFN-γ基因RT-PCR的扩增 以抽提的总RNA为模板，以Oligo dT为反转录引物，按照TOYOBO公司逆转录试剂盒操作手册进行cDNA第一链的合成。产物-20℃保存。

以cDNA为模板，扩增五莲黑猪IFN-γ基因。反应体系如下：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 2ml，上、下游引物(10 pmol/μl) 各1μl，Taq酶0.3ml，cDNA模板1ml，加灭菌蒸馏水至25ml。PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min、56℃退火40s、72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸6min。PCR反应结束后，取10μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以检查扩增结果。

1.2.3 重组质粒的构建转化及其鉴定 将扩增的PCR产物回收，与pMD-18T载体构建重组质粒，16℃连接过夜，转化利用CaCl2法制备的感受态细胞大肠杆菌DH5α，在Amp/X-gal/IPTG选择性LB固体培养基中筛选蓝白斑，选取白斑在液体LB培养基中摇菌12h。取1μl菌液，利用与1.2.2相同的条件做PCR鉴定。

1.2.4 测序 将新鲜菌液送Takara生物公司测序，ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle sequence Ready Reaction试剂盒和ABI PRISMTM 377XL测序仪，测通全序列。

1.2.5 测序结果分析 序列的同源性分析采用动态规划的方法，选用CLUSTALW软件分析，序列的电荷分布，疏水性，重复结构及周期性分析选用SAPS(Statistical Analysis of Protein Sequences)统计分析软件，局部序列的等电点采用ComputepI/MW程序计算。

1.3 三维结构分析及蛋白的同源建模

搜索自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)提供的swiss pro Modeling建模服务器，通过所提交的序列信息在蛋白质结构库中搜寻模板，在swiss-pdb viewer中通过人工方法对局部结构进行调整，采用蛋白质三维图像软件Swiss-Pdb Viewer根据距离平方和最小的叠合方法(Least squares superposition)，将蛋白质分子的结构进行叠合。

2 结果

图1 五莲黑猪IFN-γ基因RT-PCR产物电泳分析

M：DNA Maker DL2000；

1：RT-PCR产物

图2 阳性克隆菌液的PCR产物的电泳分析

M：DNA Maker DL2000；

1,2：阳性克隆菌液的产物

2.1 五莲黑猪IFN-γ基因RT-PCR的扩增

根据设计的引物对五莲黑猪肝脏中的总RNA进行RT-PCR反应，结果如图1，扩增产物位于500~750bp之间。

2.2 阳性重组质粒的筛选与鉴定

将构建的重组质粒，转化到感受态细胞DH5α中，在Amp/X-gal/IPTG选择性LB固体培养基中筛选蓝白斑。取1μl阳性克隆的菌液进行PCR鉴定(如图3)，初步证明克隆成功。

2.3 五莲黑猪IFN-γ基因序列测定结果

将鉴定后的重组克隆培养后由博亚公司进行序列测定。测定的结果表明，五莲黑猪IFN-γ基因cDNA为662bp，含一个完整的开放阅读框(ORF)，共编码166个氨基酸。测得的序列及推导的氨基酸序列如图3。

图3 五莲黑猪IFN-γ基因cDNA序列及推知的氨基酸序列

2.4 五莲黑猪IFN-γ蛋白同源建模

通过距离平方和最小的叠合方法进行预测，得到五莲黑猪IFN-γ的空间结构，发现分子结构具有2个结构域：氨基末端结构域和羧基末端结构域。如图4。

图4 五莲黑猪IFN-γ蛋白同源建模分析图

3 讨论

首次测定和分析了五莲黑猪IFN-γ基因，分析证明这种基因的特征与其它物种IFN-γ基因的特征基本一致，在以后的实验中将继续进行有关五莲黑猪抗病性能、免疫和遗传方面的研究。（1）本研究中克隆的五莲黑猪的IFN-γ基因序列与Gen-Bank上登载的猪的序列基因基本一致，无变异，说明同一物种的IFN-γ基因具有极高的保守性。猪IFN-γ基因的开放阅读框编码由166个氨基酸组成的前体蛋白，成熟的猪IFN-γ含143个氨基酸残基，推测其分子质量为17ku。此外，不同物种之间具有很高的同源性，表明在部分物种之间IFN-γ在基因方面有着极高的相似性。（2）养猪业在我国国民经济中占据着相当重要的地位，但是猪的一些烈性传染病，尤其是病毒病严重威胁着养猪业的进一步发展。研究表明，IFN-γ是一种高活性、多功能的生物活性糖蛋白，具有强烈的免疫调节作用，对寄生在细胞内的各种病原体均具有抑制作用。无论作为疫苗佐剂或其他类型的生物制剂，IFN-γ均可明显提高机体抗感染能力。但在通常情况下，机体内IFN-γ表达量甚微，不可能直接提取纯化。因此，应用IFN-γ作为疫苗佐剂或抗病毒性药物，必须通过基因工程技术体外生产重组IFN-γ，本研究对五莲黑猪IFN-γ基因的克隆为此打下了基础。

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（2011–09–13）

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1007-1733(2011)12-0003-03