汪波 张彬 龚元等

摘要：采用垂直平板十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）对我国７种常见水蛭的组织细胞可溶性蛋白成分进行电泳图谱特性分析。结果表明，７种水蛭组织细胞中可溶性蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱中多数条带相同，但也存在差异。其中日本医蛭（Ｈｉｒｕｄｏ ｎｉｐｐｏｎｉａ Whitman）蛋白条带最多，达２８个，并且吸血蛭类的蛋白条数要明显大于非吸血蛭类，而３种不同地理分布的菲牛蛭（Ｈirudinaria ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ Lesson）间表达蛋白图谱无明显差异。该研究为在分子水平分析我国水蛭不同种类、同种不同地理分布及不同食性间的差异积累了新的生物学数据，对其分类和药材鉴别提供了参考依据。

关键词：水蛭；可溶性蛋白；十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

中图分类号：Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）16－3423-03

Analysis of Soluble Proteins in Histiocyte of Seven Leech Species by SDS-PAGE

ＷＡＮＧ Ｂｏ１，ＺＨＡＮＧ Ｂｉｎ２，ＧＯＮＧ Ｙｕａｎ３，ＹＵ Ｘｉａｎｇ４，Ｌ?譈 Ｊｕｎ－ｙｉ５

（１． Ｚｈｕｈａｉ Ｃａｍｐｕｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈｕｈａｉ ５１９０８５， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｇｕａｎｇｘｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｊｉｎｇｚｈｏｕ Ｍｉｎkａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４３００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ４． Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｌｉａｏｙａｎｇ １１１０００， Liaoning，Ｃｈｉｎａ； ５． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｕｎ Ｙａｔ－Ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２７５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｌｅｅｃｈｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｌｅｅｃｈ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｈａｒｅｄ ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ； ｗｈｉｌｅ ａ ｆｅｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｅｘｉｓｔｅｄ． Ｈｉｒｕｄｏ ｎｉｐｐｏｎｉａ Whitman ｈａｄ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄｓ of ２８． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ－ｓｕｃｋｉｎｇ ｌｅｅｃｈｅｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｂｌｏｏｄｓｕｃｋｉｎｇ ｌｅｅｃｈｅｓ． Ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｈ． ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ Lesson ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ． Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｅｃｈｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ， ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｈａｂｉｔ ａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ， ａｎｄ it ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｄａｔａ ｂａｓｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｅｅｃｈ； ｓｏｌｕｂｌｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ； ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

水蛭具有医用价值，其药效在《神农本草经》中就有记载，它有破血、逐瘀、通经的功效，主要用于治疗瘤症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤［１］。水蛭种类繁多，全世界记载命名的有６８０多种，其中我国有记录的蛭类就达１００余种［２，３］。我国有医用价值的蛭类主要集中在医蛭形亚目的医蛭科、黄蛭科和山蛭科［１，４］。我国最新药典（２０１０年版）规定的药用水蛭有３种：蚂蟥（学名宽体金线蛭，Whitmania pigra Whitman）、柳叶蚂蟥（学名尖细金线蛭，Whitmania acranulata Whitman）、水蛭（学名日本医蛭，Hiruao nipponia Whitman），它们分属于黄蛭科和医蛭科［５］。在国内水蛭药材市场，一般通过形态学特征加以鉴定，易造成人为的误判，因此有必要通过理化和分子手段来进行水蛭药材的辅助鉴别。目前，有通过薄层层析和蛋白电泳方法来对历版药典收录的３种水蛭炮制品进行鉴别的报道［６－８］，而针对水蛭活体的鉴别研究仅有关于日本医蛭和天目山蛭（Haemadipsa tianmushan Song）４种同工酶蛋白电泳比较研究的报道［９］。试验采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）技术对我国７种不同食性和地理分布的水蛭活体组织细胞可溶性蛋白表达特征及差异进行了分析，为水蛭资源分析、种类鉴定和种类间遗传多样性分析提供一定参考。

１材料与方法

１．１试验材料

宽体金线蛭和光润金线蛭（Ｗｈｉｔｍａｎｉａ ｌａｅｖｉｓ Ｂａｉｒｄ）产于江苏省宿迁市，尖细金线蛭产于山东省鱼台县，日本医蛭产于湖北省公安县，３种野生菲牛蛭（Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ Ｌｅｓｓｏｎ）分别产于广东省清远市、广西壮族自治区钦州市和海南省琼中县。

１．２试验试剂

丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ－亚甲基双丙烯酰胺、ＳＤＳ和β－巯基乙醇等购自Ｓｉｇｍａ公司；过硫酸铵、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、Ｔｒｉｓ碱、溴酚蓝、冰醋酸和考马斯亮蓝Ｒ－２５０等购自广州威佳生物科技有限公司；ＲＩＰＡ裂解液、ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。

１．３蛋白样品制备及纯化

①活体水蛭低温处死后将其肠道翻出，用去离子水洗净内容物，把组织剪切成细小的碎末，用研钵在液氮条件下将样品研磨成細粉末状［９］；②取适量ＲＩＰＡ裂解液，在使用前数分钟内加入苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ），使其最终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ；按每２０ ｍｇ组织加入１５０～２５０ μＬ裂解液的比例加入裂解液；③用玻璃匀浆器匀浆至充分裂解后，将组织悬液在４ ℃，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；④小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心后的上清液，在４ ℃，１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；⑤吸取离心的上清液，分装于１．５ ｍＬ的离心管，即为电泳样品，置于－８０℃下保存；用ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

１．４水蛭组织细胞可溶性蛋白组分ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳

电源为Ｂio－Ｒad Ｆｉｒｅｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．０７ ＰｏｗｅｒｐａｃＴＭ ＨＣ，电泳槽为Ｍｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ３ Ｃｅｌｌ ６００ＶＤＣ。配制３％浓缩胶和１０％分离胶，每孔加样２５ μＬ。先以８０ Ｖ恒压１０ ｍｉｎ电泳至分离胶，再调为１８０ Ｖ恒压５０ ｍｉｎ到电泳结束；将聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色液染色４ ｈ；倾去染色液，加入脱色液，缓慢摇动脱色，直至获得蓝色条带及干净的背景［１０］。

１．５凝胶图像分析

分析软件为上海天能科技有限公司ＧＩＳ凝胶图像处理系统Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０。

２结果与分析

７种常见水蛭组织细胞可溶性蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图谱及分析结果如图１和图２所示。图１显示７种水蛭的电泳图谱总体相似度较高，但在蛋白条带数目、迁移距离、浓度等方面存在差异，分离出的蛋白组分数目从１９条至２８条不等。获得的蛋白条带数目大小依次为：日本医蛭＞菲牛蛭＞光润金线蛭＞宽体金线蛭＞尖细金线蛭；其中，日本医蛭的蛋白组分数量最多，达２８条，与其他种类差异明显；而不同地理分布的３种菲牛蛭（广东菲牛蛭、广西菲牛蛭、海南菲牛蛭）间无明显差异。

根据分子量标准蛋白及各蛋白条带的电泳迁移率，通过ＧＩＳ凝胶图像处理软件分析，结果表明在６６．２～９７．４ ku范围内，７种水蛭的蛋白电泳图谱基本一致；在１４．４～３１．０ ku范围内，广东菲牛蛭、广西菲牛蛭、海南菲牛蛭３者之间基本一致，而与其他种类存在明显差别。相同食性的吸血类水蛭日本医蛭和菲牛蛭蛋白组分条带最多，而非吸血类的光润金线蛭、宽体金线蛭和尖细金线蛭蛋白组分条带较少，统计分析结果表明吸血蛭类和非吸血蛭类的蛋白表达存在明显差异。

３讨论

根据动物组织、细胞中普遍含有受遗传基因控制的蛋白组分且具有种的特异性和稳定性的特点推断，不同物种的蛋白质电泳指纹图谱必定存在差异，以蛋白质为指标，可以从蛋白水平上进行分类［１０］。聚丙烯酰胺凝胶电泳技术作为一种蛋白分析技术，具有操作简单、快速准确、成本低且直观性强的优点，适合普及推广应用［１１］。

研究通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术比较不同种或同种不同地理分布的水蛭间活体组织细胞可溶性蛋白组成的差异，结果表明ＳＤＳ－ＰＡＧＥ能初步反映不同种类、不同食性水蛭组织细胞可溶性蛋白质的表达差异。蛋白质既是由基因决定的，也是基因的产物，作为遗传特征是可靠的［１０］。因此应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离不同水蛭可溶性蛋白质的方法对于其分类和药材鉴别具有参考价值，尤其对在形态上不易区分的种间鉴别具有重要作用。

有学者认为应用电泳和薄层色谱等生化和分子生物学技术于动物分类学中，可为其形态分类增加客观标准［１２］。研究中分析的３种不同地域分布的菲牛蛭电泳图谱无明显差异，而相同食性的日本医蛭和３种菲牛蛭则有明显差异，这一结果支持了形态分类确定的３种菲牛蛭为同一个种而菲牛蛭与日本医蛭非同种的见解［７］。同时结果表明吸血蛭类和非吸血蛭类的蛋白组分差异大，而３种非吸血蛭类间差异略有减少，这与传统的形态学分类是相一致的，也说明采用蛋白电泳来探讨种间在进化上的亲缘关系是一个很有效的手段［１２］。可见，采用电泳技术分离７种水蛭活体组织细胞可溶性蛋白组分，不仅有助于了解其蛋白组分及含量，而且在生化分类学上也有一定的参考价值［９，１２］，在以后的研究中可采用更为精确和客观的二维蛋白电泳技术对所获得的差异蛋白质更细致深入地分析［１３］。

参考文献：

［１］ 杨潼． 中国动物志［Ｍ］． 北京：科学出版社，１９９６．

［２］ 刘岱岳，余传隆，刘鹊华． 生物毒素开发与利用［Ｍ］． 北京：化学工业出版社，２００７．

［３］ ＳＫＥＴ Ｂ，ＴＲＯＮＴＥＬＪ Ｐ． Ｇｌｏｂａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｌｅｅｃｈｅｓ （Ｈｉｒｕｄｉｎｅａ） ｉｎ ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ［Ｊ］． Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，２００８，５９５：１２９－１３７．

［４］ 宋大祥，冯钟琪． 蚂蟥［Ｍ］． 北京：科学出版社，１９７８．

［５］ 中华人民共和国药典委员会． 中国药典：一部［Ｍ］． 北京：化学工业出版社，２０１０．

［６］ 江佩芬，卢建秋，王宝华． 水蛭蛋白电泳鉴别研究［Ｊ］． 中国医药学报，１９９４，９（６）：５４．

［７］ 丁家欣，张秋海，欧兴长，等． 三种水蛭的薄层色谱与电泳法鉴别［Ｊ］． 中药材，１９９４，１７（１１）：１９－２０．

［８］ 袁晓环，王春涛，王晓东．水蛭药材的鉴别［Ｊ］． 牡丹江医学院学报，２００７，２８（３）：８１－８２．

［９］ 罗媛媛，姜乃澄．日本医蛭和天目山蛭４种同工酶的比较研究［Ｊ］． 浙江大学学报（理学版），２００２，２９（１）：９９－１０２．

［１０］ 林加涵，魏文铃，彭宣宪． 现代生物学实验（下册）［Ｍ］． 北京：高等教育出版社，２００１．

［１１］ 郭尧君． 蛋白质电泳实验技术［Ｍ］． 第二版．北京：科学出版社，１９９９．

［１２］ 罗雅，潘夕观，王凤临，等． 薄层等电聚焦电泳技术应用于山蛭的分类研究［Ｊ］． 動物学研究，１９８８，９（3）：２８４－３００．

［１３］ ＢＡＳＫＯＶＡ１ Ｉ Ｐ，ＺＡＶＡＬＯＶＡ Ｌ Ｌ，ＢＡＳＡＮＯＶＡＬ Ａ Ｖ，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｌｅｅｃｈ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ），２００４，６９（７）：７７０－７７５．