胡林子 李新华 马永全 于 新

(沈阳农业大学食品学院1，沈阳 110161)

(仲恺农业工程学院轻工食品学院2，广州 510225)

响应面法优化山毛豆抑菌物质提取条件的研究

胡林子1，2李新华1马永全2于 新2

(沈阳农业大学食品学院1，沈阳 110161)

(仲恺农业工程学院轻工食品学院2，广州 510225)

以山毛豆种子为试验材料，对水浴浸提法提取山毛豆种子中抑菌物质的工艺进行研究，研究温度、提取时间、提取溶剂、提取pH对山毛豆种子中抑菌物质提取效果的影响。在单因素试验基础上，利用响应面分析法(RSM)优化山毛豆抑菌物质的提取条件。得到山毛豆抑菌活性物质的最佳提取工艺条件为:温度64℃，提取时间11 h、体积分数52%乙醇为溶剂，溶剂pH 6。该条件下体积分数为20%的山毛豆提取液对3种供试菌的抑菌圈直径均值为18．34 mm，与理论最优值18．42 mm接近。

山毛豆种子 提取 抑菌活性 响应面法

非洲山毛豆(Tephrosia vogelii Hook f．)又称福氏灰毛豆、窝氏灰叶，属豆科，蝶形花亚科，灰叶属，多年生灌木，是一种优良的水土保持、荒坡绿化、土壤改良植物［1－3］。非洲山毛豆种子含有粗脂肪13．47%，其中，不饱和脂肪酸的质量分数为66．94%，粗蛋白质量分数为38．73%，是潜在的食品与饲料优质资源［4－5］。非洲山毛豆含有鱼藤酮类化合物，是一种优良的杀虫植物，其杀虫活性的发现、研究和应用在国内外已有70多年历史［6］，前人研究了非洲山毛豆叶、茎提取鱼藤酮类物质作为生物杀虫剂使用，效果良好，但是对于山毛豆种子、叶茎提取物的抑菌作用的研究鲜见研究报道。本试验用响应面分析法(RSM Response Surface Methodology)优化提取非洲山毛豆种子的抑菌活性物质的工艺条件，旨在为山毛豆资源的利用及天然抑菌剂的开发提供研究依据。

1 材料与方法

1．1 材料

山毛豆种子:采自广州市花都区北兴镇山坡(北纬 23°27＇，东经 113°26＇);大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus):华南农业大学食品微生物实验室;乙型副伤寒沙门氏菌(Salmo-nella paratyphi B．CMCC50094)，广东省微生物研究所。培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

1．2 试剂及仪器

无水乙醇、NaOH:天津市河东区红岩试剂厂;琼脂:广州市紫兴化玻;Na2HPO4;NaH2PO4;NaCl(均为分析纯);牛肉膏(生化试剂)、蛋白胨(生化试剂):天津市河东区红岩试剂厂。

MJ－176NR型多功能粉碎机:日本松下电器产业株式会社;DHG－9140A型电热恒温干燥箱:广东环凯微生物科技有限公司;R系列旋转薄膜蒸发仪:无锡星海生化设备有限公司;电热恒温培养箱:上海索普仪器有限公司;SW－CJ－IF型无菌超净工作台:苏州净化设备有限公司;KQ5200型超声波清洗器:厦门中村光学仪器厂。

1．3 试验方法

1．3．1 提取物的制备

山毛豆粉碎过100目筛。取3份100 g于烧杯中，以料液比1∶10加入提取剂，恒温水浴浸提，四层纱布过滤，真空抽滤，旋转薄膜蒸发仪在60℃减压浓缩，得黑红色黏稠物10 mL。0～4℃冷存备用。

1．3．2 试验方案

以不同温度、提取时间、提取剂浓度、溶剂pH为因素，以抑菌圈直径为指标，根据单因素确定显著水平，在此基础上，采用Design Expert7．0统计分析软件的响应面分析法设计试验，以获取最适工艺参数［7］。

1．3．3 抑菌效力的测定

1．3．3．1 菌悬液制备

在无菌条件下，将供试菌种接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37℃培养24 h，挑取菌落，用无菌生理盐水稀释，获得 1．0×106～1．0×107CFU/mL的菌悬液，备用［8］。

1．3．3．2 提取物抑菌作用的测定

用无菌水将山毛豆提取物稀释至20%(体积分数)。采用管碟法［9］，取无菌培养皿(直径90 mm、高18 mm)，每皿加入2%的琼脂作底层。在培养基内等距离分散放置两个牛津杯(内径6 mm，外径8 mm，高10 mm)，将菌悬液加入到温度适宜的培养基中，混匀后迅速倒入培养皿，每皿约到培养基15 mL，静置20 min后待培养基凝固取出牛津杯，分别移取样品溶液150 μL加入到平板杯孔中，每个菌种每种提取物做4组平行，以无菌水空白对照。37℃培养12 h，测量抑菌圈直径，取平均值，记录结果。

2 结果与分析

2．1 单因素试验

2．1．1 温度对提取效果的影响

以50%乙醇为溶剂，调节pH为7，分别在40，50，60，70，80 ℃温度下浸提 10 h，结果见图 1。提取温度介于40～60℃时，山毛豆提取物抑菌作用随提取温度的升高呈增强趋势;当提取温度大于60℃时，抑菌作用没有显著变化。因此，较佳的提取温度约为60℃。

图1 不同温度提取物的抑菌效果

2．1．2 时间对提取效果的影响

在提取剂为体积分数50%乙醇，pH为7，温度60 ℃的条件下，分别浸提4，6，8，10，12，14 h，提取液抑菌结果如图2。

山毛豆提取物的抑菌效果随着提取时间的延长呈先增强后持平的趋势，这主要是由于开始时原料和溶剂之间的浓度差比较大，扩散速度快，有效抑菌成分浸出速度也快，但随着时间延长，非抑菌成分的溶出，造成了山毛豆提取物抑菌效果的下降。因此，10 h为较佳浸提时间。

图2 提取时间对提取物抑菌效果的影响

2．1．3 乙醇体积分数对提取效果的影响

在60℃的条件下，乙醇溶剂体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%，调节 pH 为 7，对原料浸提10 h。提取物抑菌效果见图3。

图3 乙醇体积分数对提取物抑菌效果的影响

在其他条件相同的情况下，当乙醇体积分数在30%～50%范围内，山毛豆提取物的抑菌效果随乙醇体积分数的增加而明显增强。当乙醇体积分数＞50%时，抑菌效果随体积分数的增加而显著减弱。这可能是由于当乙醇体积分数增加到一定值时，溶剂与抑菌物质极性差别增大，同时山毛豆种子中一些醇溶性杂质溶解量增大，与抑菌活性物质竞争同乙醇－水分子结合，造成抑菌物质溶解度减小。因此，选取提取剂乙醇体积分数在50%左右为适宜。

2．1．4 溶剂pH对提取效果的影响

在提取剂为50%乙醇，调节pH分别为4、5、6、7、8，在60℃的条件下，浸提10 h，提取液抑菌结果如图4。

当溶剂pH 5～pH 7时，山毛豆提取液呈现较好的抑菌效果。为上述3个自变量的编码值。

对模型进行方差分析(表3)、模型系数显著性检验(表4)。

图4 溶剂pH对提取物抑菌效果的影响

2．2 响应面法优化试验

2．2．1 试验设计及模型分析

依据 Design Expert7．0 软件(Static Made Easy，Minneapolis，MN，USA．version)，采用 Central Composite Design 建立数学模型［10］，固定溶剂 pH 6．0，以提取温度(X1)、浸提时间(X2)、乙醇体积分数(X3)值为自变量，以+1、0、－1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX对自变量进行编码。其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长，因子编码及水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表

以3种供试菌为研究对象，测定抑菌圈直径，重复3次，取平均值为响应值(Y)，测定结果见表2。

依据 Design Expert 7．0软件中的 Central Composite Design方法，以浸提温度、浸提时间、乙醇体积分数为因素设计响应面试验，对试验设计中各组提取物的抑菌效果进行回归分析，得回归方程为:

式中:Y为抑菌圈平均值的预测值;x1～x3分别

表2 响应面试验设计及试验结果

表3 回归模型方差分析表

从该方程的方差分析(表3)可知，本试验所选模型不同处理间差异极显著(P＜0．000 1)，说明回归方程应变量与全体自变量之间的相关关系是显著的，即这种试验方法可靠;失拟项 P=0．184 4＞0．05，失拟项差异不显著，表明该方程对试验拟合情况好，试验误差小，可以用该方程对不同提取条件下的抑菌效果进行预测。试验中，变异系数较低(0．55%)，说明了试验可靠性强;模型的校正决定系数R2Adj=0．994 8，说明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。该模型的信噪比(S/N)为52．997，远大于4，可知回归方程拟合度和可信度均很高，能够很好地对提取物的抑菌效力进行预测。

表4 回归方程模型系数的显著性检验

由表 4 可知，模型一次项 x2，x3，x1(P ＜0．000 1)差异极显著;二次项x12、x22、x32(P ＜0．000 1)差异极显著;交互项x1x2(P＜0．000 1)差异极显著，x1x3(P=0．320 0)差异不显著，x2x3(P=0．003 3)差异极显著。x1、x2、x3对山毛豆提取物抑菌效果影响因素主次顺序为:温度＞时间＞乙醇体积分数。

2．2．2 响应面分析与优化

模型的响应面图解结果见图5～图7。各图表示X1、X2、X3中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对提取物抑菌能力的影响［11－12］。从图5～图7中可知，时间和乙醇体积分数的交互作用相对其他因素之间的交互作用最大，而温度和时间之间的交互作用最小。

用Design－Expert软件对试验模型进行典型性分析，以获得优化的提取条件。经分析，X1、X2、X3最适值分别为:64．19 ℃，11．21 h，52．06%，理论平均抑菌圈直径为18．42 mm。

图5 温度、时间因素的交互作用对提取物抑菌效力的影响

2．3 优化条件的验证

将提取条件修正为温度64℃，提取时间11 h、乙醇体积分数52%，溶剂pH 6．0，以验证响应面法优化条件的可靠性。在优化条件下，重复试验5次，取平均值。试验测得大肠杆菌的平均抑菌圈直径为14．71 mm，金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径为20．13 mm，沙门氏菌的平均抑菌圈直径为20．18 mm，3种供试菌的抑菌圈直径均值为18．34 mm，与理论最优值(18．42 mm)仅相差0．45%。证明该模型具有一定的可靠性。

3 结论

通过提取温度、提取时间、乙醇体积分数及其pH值的单因素试验和响应面分析的各因素交互试验，对山毛豆种子抑菌活性物质的提取条件进行优化。获得优化提取条件为:温度64℃，提取时间11 h、溶剂乙醇的体积分数52%，溶剂pH 6．0。该条件下的山毛豆提取液对3种供试菌的抑菌圈直径均值为18．34 mm，与理论最优值十分接近。由此可见，通过响应面分析法优化的波提取山毛豆种子抑菌物质的工艺条件在实践上是可靠的。

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Optimizing Extraction Conditions of Antimicrobial Substance from Tephrosia vogelii Hook f．Seeds by Response Surface Methodology

Hu Linzi2Li Xinhua1Ma Yongquan2Yu Xin2

(College of Food Science，Shenyang Agricultural University1，Shenyang 110161)
(College of Light Industry and Food Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering2，Guangzhou 510225)

The antimicrobial components of Tephrosia vogelii Hook f．seeds were extracted by the water－ bath method．The conditions such as extraction temperature，time，ethanol concentration and pH for the extraction have been researched．On the basis of single factor tests，the extraction conditions were optimized with the response surface methodology．Results:The optimum conditions for the extraction are temperature 64 ℃，extraction time 11 h，using ethanol of volume concentration of 52%as solvent，and pH of 6．With these extraction conditions，the extract at a volume concentration of 20%exhibits an average value of microbe inhibition zone of 18．34 mm，close to the theoretically predicted value of 18．42 mm．

Tephrosia vogelii Hook f．Seeds，extraction，antimicrobial activity，response surface methodology

TS201．3

A

1003－0174(2011)03－0095－05

广东省科技计划(2008B030302001)

2010－03－01

胡林子，女，1985年出生，硕士，粮食油脂及植物蛋白工程

于新，男，1959年出生，教授，农产品加工与储藏