党 亚，李 敏，王秋兰，冯呈呈，王劭狮

（滁州学院材料与化学工程学院，安徽滁州 239000）

高效毛细管电泳中移动反应界面法富集奶粉中三聚氰胺的方法研究

党 亚，李 敏，王秋兰，冯呈呈，王劭狮

（滁州学院材料与化学工程学院，安徽滁州 239000）

运用移动反应界面理论建立奶粉中三聚氰胺的毛细管电泳富集分离体系。与传统的毛细管电泳相比，体系中引入了富集缓冲溶液（富集相）和分离缓冲溶液（分离相）。优化的条件：样品缓冲溶液为50mmol／L甲酸－甲酸钠（p H2.60），富集相为20mmol／L甲酸钠－甲酸p H8.00），分离缓冲溶液为50mmol／L～50mmol／L甲酸－甲酸钠（p H2.60）；样品压力进样50mbar×40s，富集相压力进样50mbar×20s，紫外检测波长232nm，电压30kv。该方法比常规电泳灵敏度高近20倍。

毛细管电泳；移动反应界面；三聚氰胺；富集；奶粉

三聚氰胺（melamine，MEL）简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。其最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂 （MF）的原料。近几年食品安全问题频繁出现，引起社会广泛的关注。其中不法商人在食品或饲料中添加三聚氰胺（即所谓的“蛋白精”），以提高蛋白质的表观含量，对人民生命安全造成很大危害。因此建立快速的检测方法以确保食品的安全十分重要。目前三聚氰胺的检测方法主要包括液相色谱法（LC）［1］、液相质谱法（LC－MS）［2］、气相色谱法（GC）和气相色谱法－质谱（GC－NS）［3］。液相色谱法因需要大量的预处理步骤而稍显麻烦。与其相比，毛细管电泳具有速度快、分离效率高、上样量小、废液少等优点。但是，由于毛细管的光路只有50～100μm，因此紫外吸收检测法的灵敏度不高。各种毛细管电泳富集方法用于提高检测灵敏度。这些富集方法包括：场放大样品富集（FASS）［4］、场放大进样富集（FASI）［5］、p H梯度、p H动态连接、以及等速电泳法［6］和扫集法［7］。

移动反应界面法（MRB）是建立在沉淀反应界面理论［8］和移动界面理论［9］基础上的一种富集方法。一系列关于移动沉淀反应界面及中和界面［10］的实验定量地证明并发展了这一理论。在MRB方法中，富集相溶液和样品缓冲溶液间形成反应界面，样品可在界面处实现富集。

MRB理论已经被进一步用于富集两性物质［11］和巴比妥类物质［12］，但这一方法用于碱性物质的富集至今见有一篇报道［13］。本文应用MRB的方法进行奶粉中三聚氰胺的富集。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

HP毛细管电泳仪（Agilent公司）配有二极管阵列检测器；Milli－Q超纯水仪（美国密理博公司）；TGL－16高速电动离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）；PHS－3C p H计（上海宇隆）；毛细管（河北永年光学仪器厂）；CP124S型分析天平。

甲酸、甲酸钠、盐酸、乙腈、甲醇（均为分析纯）；甲醇溶液：甲醇－水（体积比为20：80）。市售某品牌奶粉；三聚氰胺（滁州金丰有限公司，纯度≥99.9%）

1.2 实验条件

毛细管为52cm×75um（有效长度43.5cm）；运行电压30kv；紫外检测波长（232nm）；实验温度25℃；样品缓冲溶液为50mmol／L甲酸－甲酸钠（p H2.60）；富集相溶液为20mmol／L甲酸钠－甲酸（p H8.00）；分离缓冲溶液为50mmol／L甲酸钠－甲酸（p H2.60）；毛细管使用前均依次用1.0mmol／L NaOH冲洗30min；超纯水冲洗15min；分离缓冲溶液冲洗30min；两次进样中间用缓冲溶液冲洗3min。

1.3 溶液的配制

用甲醇溶液溶解三聚氰胺标品配成500mg／L的储备液；分别配制一系列浓度和p H值的甲酸－甲酸钠溶液及甲酸钠溶液作为样品缓冲溶液、分离缓冲溶液、富集缓冲溶液。

1.4 奶粉的前处理方法

称取2.0g奶粉两份，一份加入40ml 20%甲醇溶液，另一份加入40ml三聚氰胺储备液，各加入2.5%甲酸5ml，超声5min后各取1ml上述液体，分别加入9ml乙腈，超声10min后离心（12000r／min）取上清液在（78－80℃）下蒸干，残渣用20%甲醇溶液复溶到10ml，待上机。

2 结果与讨论

2.1 MRB基础上的富集与分离条件

三聚氰胺呈碱性（p Kb＝8）。根据MRB理论，试验在背景缓冲溶液和样品缓冲溶液之间加入一段甲酸钠溶液作为富集相，当加入高压时，样品相和富集相之间形成化学反应界面，当物质的迁移速度大于反应界面速度时，三聚氰胺进入富集相，使其带有的正电荷减少，迁移速度变慢，当进入样品相时迁移速度变快，反复进行，从而使三聚氰胺在界面富集。在本实验中，使用低p H（2.6）的甲酸缓冲溶液作为样品和背景电解质，采用20mmol／L甲酸钠（p H8.00）作为富集相缓冲溶液，当富集完成后，物质在背景电解质中分离。具体操作步骤如图1所示。

图1 基于移动反应界面的操作步骤

2.2 富集和分离条件的优化

2.2.1 分离缓冲溶液优化

三聚氰胺在酸性环境下带正电荷［14］，在电压为30kv电泳条件下，采用样品浓度为40mg／L，分离缓冲溶液浓度在50mmol／L，p H 2.60～4.0的甲酸钠－甲酸条件下，试验的最佳分离p H，研究了结果表明（如图2），随着p H的增大，三聚氰胺的迁移时间延长而且分离效率不好，又研究了p H为2.60条件下，缓冲溶液浓度从10mmol／L～70mmol／L对分离的影响，发现在50mmol／L甲酸钠－甲酸分离效果最好，综合考虑，选p H＝2.60，甲酸钠－甲酸为50mmol／L的背景缓冲溶液下进行分离。

图2 分离缓冲溶液p H对分离度的影响

2.2.2 富集相优化

在常规分离电泳条件下，选择甲酸钠（p H8.00）作为富集相，研究其浓度从10mmol／L～50mmol／L的甲酸钠对三聚氰胺富集效果的影响。结果表明如图3：随着富集相浓度的增大，峰高和分离度都有提高，但当浓度超过20mol／L时，峰高有所降低，继续增大浓度，由于奶粉中杂质也有富集现象，使分离效果变差，综合考虑用20mmol／L甲酸钠，峰形，富集效果，分离效率最好，同时研究了一系列富集相在20mmol／L甲酸钠p H值的影响结果表明只有在p H＝8.00时峰形较好，分离效率较高。

图3 富集相对分离度和峰高的影响

2.2.3 进样时间和电压优化

为达到更好的富集效果，进样时间由5s增加到60s，相应的富集相的进样时间也延长.随着富集相进样的时间的延长，三聚氰胺的迁移时间也延长，而且峰高，峰宽与进样时间关系结果如图4，但综合分离效率、峰形、峰高，最终确定样品相进样时间为40s，富集相进样20s。

图4 进样时间对富集效果的影响

研究操作电压范围为15～30kv的对分离效率、迁移时间和富集效果的影响。结果发现在低电压的电流小、迁移缓慢、分离效果较差，综合考虑到分离度、富集效果，选择操作电压为30kv。

2.3 富集效果

将最优化条件的进样时间40s和常规区带电泳条件下的进样时间3s相近峰宽条件下比较如图5，富集效果提高近20倍。

图5 富集分离与常规分离比较

3 结论

本文提出一种简单有效的富集分离奶粉中三聚氰胺的方法，这一方法样品处理简单，在复杂基体中不需过柱，只要简单处理样品就可进行富集分离。同时具有较高的分离效率，提高了毛细管电泳的灵敏度，分离成本较低，使用试剂少，经济。将进一步使用该方法用于奶粉中三聚氰胺的定量检测。

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Stacking and Separation of Melamine in Milk Powder by the Moving
Chemical Reaction Boundary Method in Capillary Electrophoresis

Dang Ya，Li Min，Wang Qiulan，Feng Chengcheng，Wang Shaoshi
（School of Material and Chemical Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239000，China）

A stacking system was based on moving reaction boundary（MRB）for stacking and separation of melamine in milk powder.The experimental conditions were optimized for the stacking of melamine as well as its separation.The optimized conditions were 50mmol／L HCOOH－HCOONa（p H2.60）as sample buffer，20mmol／L HCOONa－HCOOH（p H8.00）as stacking buffer，50mmol／L HCOOHHCOONa（p H 2.60）as separation buffer，50mbar（40s）sample phase injection and 50mbar（20s）stacking phase injection，232nm of detection wavelength，30kv of voltage.This method can be well used for stacking and separation of melamine in milk powder.

capillary electrophoresis（CE）；moving reaction boundary；melamine；stacking；milk powder

TS252.7

A

1673－1794（2011）05－0071－03

党亚（1986－），男，滁州学院2007级本科生，中科院研究生，研究兴趣：高效毛细管电泳分离富集；通信作者：李敏，副教授，Email：liminchen＠126.com。

滁州学院2010年度大学生校级研究项目（2010xs047），安徽省应用化学省级重点学科建设项目（200802187C），滁州学院科研项目（2008kj018B）

2011－03－23