吴 玲，张 敏

(1.常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系，江苏常州213164; 2.江苏省常州市出入境检验检疫局，江苏常州213003)

发酵产品中乳酸菌抑菌效果研究

吴 玲1，张 敏2

(1.常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系，江苏常州213164; 2.江苏省常州市出入境检验检疫局，江苏常州213003)

从发酵产品中分离出的20株乳酸菌中筛选得到1株乳酸菌菌株GL5，该乳酸菌对金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等致病菌具有较强的抑制性，通过细菌形态学特征的观察，生理生化特征的鉴定，并参考《伯杰细菌鉴定手册》，该菌株与干酪乳杆菌最相似。

乳酸菌，抑菌，鉴定

乳酸菌是一类能以糖为原料，发酵产生大量乳酸的细菌的通称。乳酸菌是正常人畜肠道中极为重要的生理菌群，担负着人畜机体多种重要的生理功能，具有维持人体中微生态平衡的作用。而且，乳酸菌能够产生有机酸(如乳酸、丁酸和醋酸等)、过氧化氢和细菌素等抑菌物质［1］。这些少量的抑菌物质如果被添加至食品中，不仅不破坏食品的风味和组织状态，还可以抑制腐败菌和病原菌的生长，从而防止腐败，延长食品的保藏期。其中起主要抑菌作用的是细菌素，其具有一定的热稳定性，易被人体消化道的部分蛋白酶降解，并且不会在体内蓄积引起不良反应，被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂［2］。因此，筛选高抑菌活性的乳酸菌，并将其投入生产，有着广阔的市场前景。本实验欲从各种发酵产品(如酸奶、奶酪、泡菜等)中分离乳酸菌，研究各种乳酸菌对食品中常见致病菌的抑制作用，最终筛选出抑菌效果较好的乳酸菌菌种。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

各品牌腌渍菜、进口奶酪和酸奶 市售;乳酸菌分离培养 BCG培养基，A、B液灭菌后混匀(A液:脱脂奶粉50g，1.6%溴甲酚绿酒精液0.35mL，蒸馏水250mL，90℃，开盖灭菌10min;B液:酵母膏5g，琼脂10g，蒸馏水250mL，pH 6.8，121℃灭菌20min;A、B液灭菌后在无菌状态下混匀后倒平板［3］);MRS液体培养基 蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵1.45g、K2HPO4·H2O 2.6g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐温80 1.0g、蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.4，121℃，灭菌20min;单增李斯特菌(Listeria monocytogens)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli) 均购于广东微生物菌种保藏中心;脱脂奶粉 光明乳业股份有限公司;各类糖发酵管、SS培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司;酵母膏、蛋白胨、牛肉膏 均为生化试剂;葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸三铵等 均为分析纯试剂。

SHP-150恒温培养箱 上海山连实验设备有限公司;GL-21M高速冷冻离心机 上海市离心机械研究所有限公司;FD-1D-5型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 泡菜样品处理:以无菌操作取各种泡菜汁液1mL，并用无菌生理盐水依次稀释为10-3、10-4、10-5。奶酪、酸奶样品处理:以无菌操作取奶酪(或酸奶)1g，放入含有9mL灭菌加热至含40℃左右生理盐水的灭菌广口瓶内，待奶酪溶解制成1∶10的均匀稀释液，并用无菌生理盐水逐级稀释至10-3、10-4、10-5。

1.2.2 乳酸菌的分离纯化 采用BCG牛乳培养基对稀释样品中的微生物通过平板倾注法进行分离纯化，37℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。挑取少量进行革兰氏染色并镜检，筛选出符合乳酸菌形态特征的菌株［4］，并将其保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，编号，待用。

1.2.3 乳酸菌的抑菌实验-管碟法 将初筛的乳酸菌菌株转接于MRS液体培养基中活化，37℃培养48h，将发酵液在4℃下，以10000r/min的转速离心10min，取上清液并测定其pH，将上清液用1.0mol/L NaOH调至pH6.5后［5］，利用管碟法测定不同乳酸菌发酵液对各指示菌的抑制作用。

1.2.4 乳酸菌的鉴定 乳酸菌的鉴定具体参见《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》与《乳酸细菌分类鉴定与实验方法》。

1.2.5 乳酸菌的保藏 将具有较强抑菌活性的乳酸菌活化培养，并加入一定的保护剂［6］，在-76℃及真空下冻干3d后，置-20℃冰箱贮藏。

2 结果与讨论

2.1 抑菌实验结果

通过BCG培养基，从各品牌腌渍菜、进口奶酪和酸奶中共筛选出20株疑似乳酸菌。经管碟法抑菌实验验证，从泡菜汁中分离出的2株乳酸菌(分别命名为PC3和PC15)和从进口奶酪中分离出的1株乳酸菌(命名为GL5)对指示菌金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌都有很好的抑制作用，结果见表1。其中，GL5抑菌效果最佳，如图1所示。各种乳酸菌对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌。

图1 GL5菌株抑金黄色葡萄球菌实验结果

表1 三种乳酸菌对各指示菌的抑菌圈直径(mm)

2.2 乳酸菌的鉴定

2.2.1 形态特征观察 GL5菌株经革兰氏染色为G+，显微镜观察为杆状，长短不一，多成链出现，无鞭毛，无芽孢。菌落光滑，凸起，大部分为白色，有个别黄色。

2.2.2 生理生化特征鉴定 生理生化特征鉴定主要实验项目包括GL5在不同温度(15、35、45℃)实验菌种的生长情况，在不同pH(4.5、5.4、9.0)培养基中的生长情况，过氧化氢酶实验，明胶液化实验，吲哚实验，硫化氢产生实验，精氨酸产氨实验与各种糖发酵实验。

表2 GL5菌株生理生化实验结果

根据菌种的形态特征与生理生化特性，参考资料［4，7］，将GL5初步鉴定为乳杆菌属。接着对GL5菌株进行糖发酵实验，实验结果如表3所示。

表3 GL5菌株糖发酵实验结果

根据生理生化实验结果，参考资料［4，7］，经过删选比对，菌株GL5的生理生化特性与干酪乳杆菌最相似。

3 结论

从发酵产品中分离纯化了20种乳酸菌，通过管碟法抑菌实验筛选出一种来源于进口奶酪的抑致病菌活性较高的乳酸菌GL5，通过形态学观察与生理生化实验，菌株GL5初步鉴定为干酪乳杆菌。

［1］杨洁彬，葛兴华.乳酸菌——生物学基础及应用［M］.北京:中国轻工业出版社，1996.

［2］朱小乔，刘通讯.极具潜力的天然防腐剂——Nisin［J］.食品与发酵工业，2001，27(4):66-69.

［3］王友湘，陈庆森，阎亚丽.用于乳酸菌分离鉴定的几种培养基的筛选及应用［J］.食品科学，2007，28(9):374-378.

［4］凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法［M］.北京:中国轻工业出版社，1999:6-16.

［5］贺银凤，靳烨，田建军，等.两株产抑菌物质乳酸菌的鉴定及系统发育分析［J］.食品科学，2009，30(19):232-235.

［6］吴玲，潘道东，刘海燕.瑞士乳杆菌冻干保护剂的选择［J］.食品与机械，2010，26(1):157-159.

［7］布坎南RE，吉布斯NE.伯杰细菌鉴定手册［M］.第八版.北京:科学出版社，1984:797-808.

Study on bacteriostatic effect of lactic acid bacteria in the fermented products

WU Ling1，ZHANG Min2

(1.Department of Pharmaceutics＆Biology Engineering and Technology，Changzhou Institute of Engineering Technology，Changzhou 213164，China;2.Changzhou Entry-Exit Inspection and Quanrantine Bureau，Changzhou 213003，China)

20 kinds of lactic acid bacteria were isolated from fermented products，and GL5 from cheese had the highest bacteriostatic activity against pathogenic bacteria such as Staphyloccocus aureus，Enterobacter sakazakii，and Salmonella typhimurium，et al.GL5 was homologous with Lactobacillus casei based on the morphological，physiological characteristics and Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

lactic acid bacteria;bactriostasis;indentification

TS201.3

A

1002-0306(2011)11-0181-02

2011-07-18

吴玲(1981-)，女，硕士研究生，讲师，研究方向:食品微生物。