李 杨，江连洲，*，王 梅，刘 琪

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.国家大豆工程中心，黑龙江哈尔滨150030）

碱性蛋白酶酶解绿豆分离蛋白制备多肽的工艺研究

李 杨1，2，江连洲1，2，*，王 梅1，刘 琪1

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.国家大豆工程中心，黑龙江哈尔滨150030）

选用Protex-6L碱性蛋白酶对绿豆分离蛋白进行酶法水解生成多肽,以多肽肽得率为考察指标，对其酶解工艺进行研究。基于单因素实验，考察了酶解条件：pH、酶解温度、底物浓度、加酶量、酶解时间等对酶解的影响,利用Design Expert7.1.1软件设计响应面对酶解条件进行优化分析。结果表明：pH9.37、酶解温度55℃、底物质量分数7.0%、加酶量5000.02U/g条件下酶解4.76h，多肽得率可达到91.37%。

Protex-6L碱性蛋白酶，多肽得率，响应面

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆粉 60目，自制；Protex-6L碱性蛋白酶 novo公司，1.0×105U/g；其他试剂 均为分析纯。

电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LDZ5-2型台式低速离心机 上海安亭科学仪器厂；KDN-04Ш型蛋白质测定仪，HYP-1020二十孔消化炉 上海纤检仪器有限公司；DU800型紫外分光光度计 美国贝克曼库尔特有限公司；电热恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 绿豆分离蛋白的提取[6]绿豆磨粉过60目，加水溶解，将稀释液调pH至10.0，30℃下搅拌30min。充分搅拌后4000r/min离心20min，取上清液，沉淀物加水调pH至10.0，同样方法再次离心，得到的上清液与之前的合并，调pH至4.6，离心，取沉淀进行冷冻干燥，即得绿豆分离蛋白。

1.2.2 蛋白质测定 凯氏定氮法（GB5009.5-2010）。

1.2.3 酶活力测定 福林酚法[8]。

1.2.4 TCA-NSI测定 依据三氯乙酸（TCA）可溶性氮法（NSI）法（Jang chudA，1999），多肽得率（%）计算公式为：

式中：TCA-NSI—三氯乙酸可溶性氮得率，%；N1—在10%TCA中可溶性氮，mg；N2—原料大豆中总氮，mg。

1.2.5 酶解反应工艺流程[9]以蒸馏水配制一定浓度的绿豆分离蛋白溶液，调节pH至实验设定值，在实验设定的温度加入反应所需的酶，同时低速搅拌混合。反应过程中以1mol/L的NaOH溶液严格控制酶解液的pH，酶解一定时间后，再以等体积比加入三氯乙酸（TCA，10%）并放置于60℃水浴中加热10min，将未反应完全的蛋白质沉淀，用10000r/min的转速离心15min，取上清，测体积，然后定氮。

1.2.6 碱性蛋白酶酶解绿豆分离蛋白单因素实验

1.2.6.1 pH对酶解的影响 实验选择在Protex-6L复合蛋白酶的工作pH范围内（pH8～10），以温度65℃，底物浓度9%，酶浓度6000U/g条件下，酶解4h。分别考察了pH为8.0、8.5、9.0、9.5和10.0对酶解绿豆分离蛋白制备多肽的影响，测其多肽得率。

1.2.6.2 温度对酶解的影响 实验在Protex-6L复合蛋白酶的工作温度范围为50～70℃，在pH9，底物浓度9%，酶浓度6000U/g条件下，酶解4h。分别考察了温度在50、55、60、65、70℃对酶解绿豆分离蛋白制备多肽的影响，测其多肽得率。

1.2.6.3 底物浓度对酶解的影响 实验选择底物浓度范围为6%～10%，在pH9，酶解温度60℃，酶浓度6000U/g条件下，酶解4h。分别考察了底物浓度在6%、7%、8%、9%和10%时对酶解绿豆分离蛋白制备多肽的影响，测其多肽得率。

1.2.6.4 加酶量对酶解的影响 实验选择酶浓度范围为4000～8000U/g，在pH9，酶解温度60℃，底物浓度9%条件下，酶解4h。分别考察加酶量在4000、5000、6000、7000、8000U/g对酶解绿豆分离蛋白多肽的影响，测其多肽得率。

1.2.6.5 酶解时间对酶解的影响 实验选择在pH9，酶解温度60℃，底物浓度8%，酶浓度6000U/g条件下，分别酶解2、3、4、5、6h。考察其对酶解绿豆分离蛋白多肽的影响，测其多肽得率。

1.2.7 响应面分析法 以单因素实验为基础，利用Design Expert7.1.1软件设计，进一步对实验参数进行优化，因素水平见表1。

表1 因素水平表

2 结果与分析

2.1 Protex-6L碱性蛋白酶酶解绿豆分离蛋白制备多肽的单因素实验

2.1.1 pH对多肽得率的影响 pH对酶促反应的影响主要有：在不适的酸碱环境中，酶的空间构象会发生改变，可能导致酶失活；同时pH决定了底物与酶的解离状态，影响它们的结合，从而影响蛋白质的水解程度，对制得的多肽质量有所影响。实验结果（见图1）表明，Protex-6L碱性蛋白酶在pH=9.0时多肽得率较高。

图1 pH对酶解反应的影响

2.1.2 温度对酶解的影响 温度对酶促反应影响的原因概括地说主要有两个方面：一是温度对蛋白酶稳定性的影响，即对酶热变性失活作用；二是温度对酶促反应本身的影响，其中可能包括影响酶和底物的结合，影响最大速率（Vmax），影响酶和底物分子解离基团的解离常数（pK），影响酶与抑制剂、激活剂或辅酶的结合等。实验结果（见图2）表明，Protex-6L碱性蛋白酶在温度为65℃时多肽得率较高。

图2 温度对酶解反应的影响

2.1.3 底物浓度对酶解的影响 过高的底物浓度易造成水解液黏度增大，影响蛋白酶的扩散，对蛋白质链断裂反应有抑制作用。在底物浓度一定的时候，理论上酶分子越多，则酶与底物之间作用越频繁。随着底物浓度的减少，底物相对酶的浓度减少。当底物浓度小到一定程度时，酶的数量就趋于过剩，单位时间内一部分酶分子不与底物结合，造成蛋白质链断裂反应变缓慢。实验结果（见图3）表明，Protex-6L碱性蛋白酶在底物浓度8%时多肽得率较高。

图3 底物浓度对酶解的影响

2.1.4 加酶量对酶解的影响 在蛋白质的酶解实验中，增大酶浓度可以增加酶与底物之间结合的几率，从而增强酶解程度。当酶浓度增加到一定值后，上升的趋势减缓。因此，对于酶的添加量需要进行权衡。实验结果（见图4）表明，Protex-6L碱性蛋白酶在酶浓度在6000、7000U/g时多肽得率较高，但是增长趋势不明显，为了经济效应考虑，选择6000U/g酶浓度为好。

图4 加酶量对酶解的影响

2.1.5 酶解时间对酶解的影响 随着酶解时间的延长，水解度逐渐增大，这是由于随时间的延长，蛋白酶逐渐作用，直至酶全部饱和，这时蛋白水解度达最大值，但随着时间继续延长，由于有少量水解的肽链又重新连接，导致其水解度不再增高，反而略微下降，使得多肽得率下降。实验结果（见图5）表明，Protex-6L碱性蛋白酶在4h多肽得率达最高值，再继续酶解，多肽得率有所下降。

图5 酶解时间对酶解的影响

2.2 响应面实验结果

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，本实验以多肽得率Y为响应值，利用Design Expert7.1.1软件设计了5因素3水平的响应面法实验，共有46个实验点，其中40个为析因点，6个为零点以估计误差。实验设计和结果见表2，方差分析见表3。

表2 Box-Behnken设计方案及响应值结果

2.2.1 方差分析 利用软件对实验结果进行二次多元回归拟合，对表2的数据进行方差分析后得到模型的二次多项回归方程为：

表3 方差分析表

由表3可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著（p＜0.0001），失拟项不显著，并且该模型R2=93.82%，R2Adj=88.87%，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到因子贡献率为：x4＞x5＞x3＞x1＞x2，即加酶量＞酶解时间＞底物浓度＞酶解pH＞酶解温度。

2.2.2 响应面分析 应用响应面优化分析方法对回归模型进行分析如图4，可以看出pH（x1）与酶解温度（x2）、pH（x1）与加酶量（x4）、酶解温度（x2）与底物浓度（x3）、酶解温度（x2）与酶解时间（x5）以及加酶量（x4）与酶解时间（x5）的交互作用对水解度的影响。由此可知，酶解温度在55～65℃范围内，酶解时间对水解度的因子贡献率虽然小，但酶解温度与其他因素的交互作用对多肽得率影响较大。

2.2.3 最佳水解条件的预测和验证 用DesignExpert7.1.1软件进行优化，优化方案有29组，经过实验验证：pH9.37、酶解温度为55℃、底物质量分数7.0%、酶量5000.02U/g、酶解时间为4.76h、肽得率最优值为91.37%。说明优化后的回归方程对绿豆分离蛋白的水解进行分析和预测是非常可靠的。

3 结论

图6 各酶解参数交互显著项对多肽得率的响应面分析

选用Protex-6L碱性蛋白酶对绿豆分离蛋白进行酶法水解制备多肽，经实验证明是可行的，其多肽得率可达到91.37%。且Protex-6L碱性蛋白酶是现有蛋白酶中水解度较高、稳定性好、应用广泛的一种，为以后工业化生产可提供一定的理论依据。实验所得的最优条件是pH9.37、酶解温度为55℃、底物质量分数7.0%、酶量5000.02U/g、酶解时间为4.76h。

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[8]中华人民共和国轻工行业标准.QB/T1803-1993.工业酶制剂通用实验方法[S].1993-7-29批准，1994-03-01实施.

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Study on preparation of small peptides by hydrolyzing isolate mung bean protein with Protex-6L proteinase

LI Yang1,2,JIANG Lian-zhou1,2,*,WANG Mei1,LIU Qi1
（1.Food College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Soy Bean Engineering Technique Research Center，Harbin 150030，China）

Protex-6L proteinase was used to hydrolyzing isolated mung bean protein，in order to prepare small peptides.Index was investigated by peptide yield，its enzymatic hydrolysis was studied.Based on single factor experiments，the effects of hydrolysis conditions:pH，reaction temperature，substrate concentration，enzyme dosage，reaction time were studied.Design by Design Expert7.1.1 to optimize the response of the face of hydrolysis conditions.The results showed that pH 9.37，reaction temperature 55℃，7.0%substrate concentration，enzyme 5000.02U/g under the conditions of hydrolysis 4.76h，peptide yield was 91.37%.

Protex-6L protease；peptide yield；response surface

TS201.2+5

B

1002-0306（2011）10-0384-05

绿豆（Vignaradiata）又名青小豆，古名菉豆、植豆，属豆科豇豆属，原产于我国，种植历史悠久，分布广泛，产量丰富。绿豆营养成分全面，蛋白质含量达19.5%～33.1%，功效比为1.87，远高于小麦、稻谷、玉米等粮食作物；且氨基酸种类齐全、配比均衡[1]，特别是赖氨酸的含量较为丰富，接近鸡蛋蛋白质[2]。其味甘、性寒，有清热解毒、消暑止渴、利尿消肿、解毒保肝之功效，具有良好的食用和药用价值。目前对绿豆的利用多侧重于绿豆淀粉，而忽略了绿豆蛋白的开发，造成了资源浪费，增加了下游处理成本[3]。绿豆肽是绿豆分离蛋白经水解而成的低聚肽混合物，相比绿豆蛋白，其氨基酸组成与结构几乎没有改变，但相对分子质量较小，具有水溶性高、黏度低、稳定性强等优点。其吸收机制优于游离氨基酸[4]，有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节、降血脂、降胆固醇等作用[5]，用作食品原料，还可以降低食品硬度，改善口感，因此具有广阔的市场开发前景。现代营养学研究表明，人体摄入的蛋白质经消化道中的酶作用后，大多是以寡肽的形式被消化吸收，而以游离氨基酸形式被吸收的比例很小，因此开发有益于人类健康的功能性肽具有广阔的市场前景[6-7]。本文采用Protex-6L复合蛋白酶，酶解绿豆分离蛋白制备低聚肽和氨基酸混合物，作为食物添加剂，具有广泛的用途。

2011-08-01 *通讯联系人

李杨（1981-），男，讲师，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。