张红星，刘 丽，刘 慧，谢远红，陈湘宁

（北京农学院食品科学系，北京102206）

乳酸菌中抗李斯特细菌素的筛选及理化性质分析

张红星，刘 丽，刘 慧，谢远红，陈湘宁*

（北京农学院食品科学系，北京102206）

从鱼肉丸中分离筛选到1株具有抑菌活性的乳酸菌菌株Y153，对单核细胞增生李斯特菌ATCC54003的生长具有良好的抑制作用。16S rRNA序列同源性分析鉴定乳酸菌Y153为乳酸链球菌属（Streptococcus）。在排除有机酸、过氧化氢的干扰后，确定该抑菌物质为蛋白类物质，即细菌素，命名为细菌素Y153。理化性质分析表明，细菌素Y153具有较好的热稳定性、酸碱稳定性可被人体内蛋白酶降解的特性。由此对乳酸链球菌所产细菌素Y153有了初步的研究，为开发天然的食品防腐剂奠定理论基础。

乳酸菌，抗李斯特，细菌素，理化性质

1 材料与方法

1.1 材料与设备

分离源 各类肉制品（鱼肉丸、牦牛干、鱼干、腊肠等）；指示菌菌株 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC54003，为中国农业大学食品学院406实验室保藏菌种；乳酸菌分离培养基 胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸粉5.0g、柠檬酸三铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g、琼脂15.0g、水1L，pH6.5，121℃灭菌20min，当MRS培养基冷却至45～50℃时，加入适量已灭菌的碳酸钙粉末,充分混匀,倒平板；改良的MRS培养基 胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸粉5.0g、柠檬酸三铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g、琼脂15.0g、水1L，pH6.5；单核细胞增生李斯特氏菌培养基 胰蛋白胨17.0g、大豆胨3.0g、酵母浸粉6.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、水1L，固体培养基则加入1.5%的琼脂，pH6.5；培养基中使用的药品 均为国产分析纯；细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；16S rRNA的PCR扩增引物 由上海生工生物技术有限公司合成，鉴定乳酸菌的引物：上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。鉴定乳酸菌所产细菌素的引物：上游引物：5′-CAAGATCGTTAACCAGTTT-3′；下游引物：5′-CCGTTGTTCCCATAGTCTAA-3′。

UV-1800型紫外分光光度计 日本；PHS-3B便携式酸度计 雷磁；5417R台式高速冷冻离心机Thermo；MLS-3750全自动高压灭菌锅 SANYO；DL-CY-1N型超级洁净工作台 北京东联哈尔；WS-01恒温恒湿培养箱 湖北黄石恒丰；梯度PCR仪C1000 BIO-RAD。

1.2 实验方法

1.2.1 肉制品中乳酸菌的分离 将肉制品研磨后，用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布到乳酸菌分离培养基上，37℃恒温恒湿箱培养，挑选有溶钙圈的菌落，在MRS培养基上多次划线纯化，挑取单菌落，接种斜面，培养24～36h，4℃保藏备用。

1.2.2 指示菌的培养 将单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC54003接种于液体培养基中，于摇床上振荡培养过夜，4℃保藏备用。

1.2.3 抑菌乳酸菌的初筛 将乳酸菌活化培养后，以1%接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养到稳定期，12000r/min，4℃离心10min，收集上清液，用1mol/L NaOH调pH值至6.0，以排除有机酸的干扰[6-7]。4℃保藏备用。

抑菌实验采用牛津杯法[8]：先将指示菌稀释至107cfu/ mL，与加热融化的固体培养基混匀后，倾注约15mL于平皿中，待其凝固后，轻轻放上牛津杯，取100μL上清液加入牛津杯。4℃冰箱扩散4h后，置于37℃恒温箱中培养12h，观察抑菌圈的出现。

1.2.4 产细菌素乳酸菌的复筛 分别用过氧化氢酶、链霉蛋白酶E、胰蛋白酶和蛋白酶K在各自作用的最适pH值下处理发酵上清液，各酶的终浓度是1mg/mL，37℃水浴2h后，再调回pH6.0，采用牛津杯法做抑菌实验，对照为未做处理的pH6.0的发酵上清液。

1.2.5 产细菌素乳酸菌的16SrRNA序列同源性分析鉴定 乳酸菌基因组DNA的提取使用天根生化公司的细菌基因组提取试剂盒。PCR扩增的引物分别为上游引物（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和下游引物（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反应体系（50μL）：DNA模板1μL，dNTP 4μL，10×PCR buffer 5μL，上下游引物各1μL，Taq酶1μL，ddH2O 37μL。PCR扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR纯化产物送上海生工生物技术有限公司纯化测序。得到的PCR产物序列通过BLAST在基因库中进行同源性比较，并将其鉴定到种。

1.2.6 热稳定性实验 将发酵上清液调pH至6.0，分别做如下处理：60℃10min，60℃30min，60℃90min，100℃10min，100℃30min，100℃90min，121℃15min，做抑菌实验。

1.2.7 酸碱稳定性实验 将发酵上清液分别调pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，37℃处理2h，再调回pH为6.0，做抑菌实验。

2 结果与分析

2.1 肉制品中乳酸菌的分离

采用微生物学方法，从各类肉制品（鱼肉丸、牛肉丸、羊杂、鱼干、腊肠）中分离乳酸菌5株，形态学观察其中包括球菌3株 （分离自鱼肉丸、牛肉丸和腊肠）和杆菌2株（分离自羊杂）。

2.2 抑菌乳酸菌的初筛

采用牛津杯法，从5株乳酸菌中初步筛选到1株（分离自鱼肉丸）对指示菌生长有抑制作用的乳酸菌，抑菌圈直径达到14.0mm，将其命名为Y153。观察Y153的菌落形态：菌落呈乳白色、圆形、突起，边缘圆滑。归类于革兰氏阳性的乳酸球菌。

2.3 产细菌素乳酸菌的复筛

图1 抑菌物质对蛋白酶的敏感性

发酵上清液用链霉蛋白酶E、胰蛋白酶和蛋白酶K处理后抑菌圈完全消失，表明这种抑菌物质可以被人体内的蛋白酶所降解，不会在人体内残留，见图1。用过氧化氢酶处理的发酵上清液和未做处理上清液的抑菌圈大小基本一致，为14.0mm，表明发酵上清液中存在的抑菌物质是细菌素，而非过氧化氢。将菌株Y153代谢过程中产生的细菌素命名为细菌素Y153。ɑ-淀粉酶处理后发酵上清液的抑菌圈缩小而且抑菌圈由对照中透亮的状态变得很模糊，说明细菌素Y153的抑菌活性依赖于糖基化修饰[9]。

2.4 菌株Y153的16S rRNA序列同源性分析鉴定结果

以菌株Y153基因组DNA为模板，采用16S rRNA引物进行PCR扩增，得到约1500bp的特异性扩增产物，见图2。将测序结果在NCBI网站中应用BLAST软件在基因库中进行同源性搜索，结果如图3所示。Y153的16S rRNA PCR扩增产物与Streptococcus macedonicus strain ChF-II-str93（No.HM462406）的基因序列同源性达到99.67%，根据以上情况得出，Y153为乳酸链球菌属（Streptococcus）。

图2 Y153的16SrRNA PCR产物电泳图注：M-DNA Marker DL2000；1-阴性对照；2-16S rRNA PCR扩增产物。

图3 Y153的16SrRNAPCR扩增产物与Streptococcusmacedonicus ChF-II-str93（No.HM462406）的基因序列同源性比较

2.5 热稳定性实验

将乳酸链球菌Y153的发酵上清液调pH至6.0后，用不同的温度处理不同的时间后做抑菌实验，结果见图4，细菌素经100℃处理30min后，抑菌圈大小与对照基本相同，为14.5mm。100℃处理90min抑菌圈略有缩小，抑菌直径为11.0mm，表明此细菌素热稳定性较好。

图4 细菌素Y153的热稳定性

2.6 酸碱稳定性实验

将乳酸链球菌Y153的发酵上清液调至不同的pH处理后，做抑菌实验，结果见图5，细菌素在pH2～10的范围内抑菌效果很稳定，表明此细菌素具有较好的酸碱稳定性。

图5 细菌素Y153的酸碱稳定性注：1-pH 2.0；2-pH 4.0；3-pH 6.0；4-pH 8.0；5-pH 10.0；6-pH 12.0。

3 结论

鱼肉丸中筛选的乳酸链球菌所产细菌素Y153具有较好的热稳定性、pH2～10范围内有极强的抑菌活性且不在人体内残留。但是乳酸链球菌属中有些菌是存在于人体口腔和肠道的正常菌群，有些是人和温血动物的致病菌。细菌素应用于食品防腐有两种方式：一种是直接添加细菌素生产菌株，其前提条件是细菌素产生菌是益生菌，不会对人体造成伤害；另一种方式是添加细菌素纯品，这就需要采用纯化方法来提取、纯化细菌素。乳酸链球菌Y153是否对人体有害，需要进一步研究加以确定。

根据细菌素结构、相对分子量、热稳定性以及抑菌谱等特性，目前可将乳酸菌细菌素的主要细菌素纯品，分为三大类[10]：Ⅰ类是羊毛硫细菌素，分子内硫醚环中含有稀有氨基酸修饰后的小肽（小于5ku）；Ⅱ类细菌素是不含羊毛硫氨酸、小的热稳定性多肽（小于10ku）；Ⅲ类细菌素是大的热不稳定的蛋白（30ku以上）。Tricine-SDS-PAGE电泳可以确定细菌素的分子量，从而对细菌素的分类情况加以判断，课题组目前正在进行。

本研究从鱼肉丸中筛选到一株对单核细胞增生李斯特菌有抑菌活性的乳酸链球菌菌株Y153，对所产细菌素的理化特性进行了初步的研究，旨在为该细菌素在食品保鲜防腐中的应用提供理论依据。

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Screening of anti-Listeria bacteriocin of lactic acid bacteria and its physicochemical characteristics

ZHANG Hong-xing，LIU Li，LIU Hui，XIE Yuan-hong，CHEN Xiang-ning*
（Department of Food Science，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）

Strain Y153，isolated from fish balls，produced antimicrobial substance which was inhibitory to Listeria monocytogenes 54003.Strain Y153 was identified as Streptococcus by using 16S rRNA gene sequence homology analysis.After eliminating the effect of organic acid and hydrogen peroxide，the antimicrobial substance with its proteinaceous nature was confirmed as bacteriocin.Bacteriocin Y153 was heat-stable and remained activity after incubation at a wide pH.It could be degraded by proteases existing in the human body. A preliminary study on the bacteriocin producted by Streptococcus strain Y153 had been made to lay the basis for the development of natural food preservative.

Lactic acid bacteria；anti-Listeria；bacteriocin；physicochemical characteristics

TS201.1

A

1002-0306（2011）10-0231-04

乳酸菌是指发酵糖类、主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运动。菌体常排列成链。在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵，而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO2等物质的称为异型乳酸发酵。有微好氧菌和专性厌氧菌。根据细胞为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌族（Streptococceae）和乳酸杆菌族（Lactobacilleae）。其中，乳酸链球菌族，菌体球状，通常成对或成链，在固体培养基上菌落较小，生长缓慢。多数为同型发酵，如链球菌属（Streptococcus），是与人类关系密切的重要菌群，有些菌是人和温血动物的致病菌；有些是人体的正常菌群存在于口腔和肠道；有些是乳制品及植物发酵食品中的常用菌，常在食品工业中使用，如乳链球菌（S.lactis）。少数为异型发酵，如肠膜状明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）是制药工业上生产右旋糖酐的重要菌种，但也是制糖工业的一种有害菌，常使糖汁发粘稠而无法加工[1-2]。细菌素是乳酸菌代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质类物质，抑菌对象主要是近缘菌株，而某些细菌素如nisin则具有广谱性的抑菌能力[3-4]。目前，将细菌素作为防腐剂应用到食品中有如下报道：nisin能很好地抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长；乳杆菌素sakacin能抑制单核细胞增生的李斯特菌；明串珠菌细菌素对李斯特菌、乳球菌、粪肠球菌都有抑制作用；片球菌属产生的细菌素对产气荚膜梭菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌等G+菌以及恶臭假单孢菌、嗜水气单孢菌都具有抑制作用等[5]。课题组从鱼肉丸中筛选到了1株对单核细胞增生李斯特菌的生长有良好抑制作用的乳酸链球菌菌株Y153，并对所产细菌素在酶敏感性、热稳定性和酸碱稳定性方面进行了研究，为开发天然的食品防腐剂奠定理论基础。

2010-10-21 *通讯联系人

张红星（1970-），男，副教授，研究方向：食品生物技术与功能乳品。

北京市教委资助项目“农产品加工及贮藏工程重点学科建设”（PXM2009_014207_078172）。