张兴灿，陈朝银，李汝荣

（昆明理工大学-清华大学生物资源开发研究所，云南昆明650224）

木瓜蛋白酶的活力检测标准研究

张兴灿，陈朝银*，李汝荣

（昆明理工大学-清华大学生物资源开发研究所，云南昆明650224）

分别按国家标准和企业标准中紫外分光光度法测定了两个酶制剂企业生产的木瓜蛋白酶酶活力，结果表明，企业标准与国家标准测定的酶活力两种方法测定的结果差别高达几十倍，原因可能与底物溶液的pH、反应条件和巯基还原剂半胱氨酸盐酸盐有关。

木瓜蛋白酶，酶活测定，标准*

木瓜蛋白酶（Papain，EC 31412212）是一种具有广泛底物专一性的含巯基蛋白酶，有很强的分解蛋白质的能力，此外也具有水解酰胺键和酯键的特性[1]。由于它具有适用pH范围广、热稳定性好等优点，广泛应用于医药、食品、纺织、制革、饲料、染料等工业生产中。活力是蛋白酶最重要的质量指标，目前国家仅有蛋白酶制剂的通用标准[2]，由于对各类蛋白酶制剂尚无标准规定，企业、生产厂商通常根据国家蛋白酶制剂通用标准制定自己公司特定蛋白酶的企业标准。例如，目前我国的一些植物蛋白酶制剂工厂已在生产木瓜蛋白酶，但对于木瓜蛋白酶的质量检测，特别是酶活性检测的方法、条件和标准比较混乱，使产品保存和销售受到严重影响[3]。为了提高产品质量，增强国际市场的竞争能力，亟待加强管理和统一检测标准。经我们研究发现，企业标准与国家标准测定的酶活力的差值竟然高达几十倍，这说明我国的酶制剂市场存在着较大的漏洞。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品 选用两个酶制剂公司生产的木瓜蛋白酶产品，以酪蛋白为底物，测定木瓜蛋白酶的酶活性；酶活力单位定义 在测定条件下每分钟水解酪蛋白释放出的三氯乙酸可溶物在280nm处的消光值相当于浓度为1μg/mL酪氨酸消光时所需的酶量，为一个酶活力单位（U）。

Ultrospec2100型紫外分光光度计 Amersham Pharmacia公司；HH-S型恒温水浴锅 郑州长城科工贸有限公司；实验所用试剂 均为分析纯。

1.2 国标GB/T 23527-2009规定的方法[4]

1.2.1 试剂与溶液

1.2.1.1 三氯乙酸 称取三氯乙酸65.4g/L，用水溶解并定容至1000mL。

1.2.1.2 缓冲溶液 因为木瓜蛋白酶是中性蛋白酶，采用磷酸缓冲液（pH=7.5），分别称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

1.2.1.3 L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL） 精确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸（0.1000±0.0002）g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。

吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。

1.2.1.4 氢氧化钠溶液（20g/L） 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900mL并搅拌溶解。待溶液到室温后，以水定容至1000mL，搅拌均匀。

1.2.1.5 盐酸溶液 浓度为1mol/L及0.1mol/L，按GB/T 601配制。

1.2.1.6 酪蛋白溶液（10.0g/L） 称取标准酪蛋白（NICPBP国家药物标准物质）1.000g，精确至0.001g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中加热煮沸30min，并不时搅拌至酪蛋白全部溶解。冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。定容前检查并调整pH至相应缓冲液的规定值。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。

1.2.2 分析步骤

1.2.2.1 标准曲线的绘制 L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。

表1 L-酪氨酸标准溶液

分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。其K值应在130～135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。

1.2.2.2 样品的测定 待测酶液的制备：称取酶样品1～2g，精确至0.0002g。然后用相应的缓冲溶液充分溶解，然后取滤液（慢性定性滤纸）稀释至适当的浓度。测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：

式（1）中：X1—由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力，u/mL；X2—样品的酶活力，u/g；V—溶解样品所使用容量瓶的体积，mL；n—稀释倍数；8—反应试剂的总体积，mL；2—吸取酶液的体积，mL；m—样品的质量，g；1/10—反应时间10min，以1min计。

1.3 按两个公司各自的企业标准进行测定[5-6]

其中一个公司的企业标准为Q/JWLSW 01-2007（木瓜蛋白酶），另一个公司的企业标准为Q/NPB 01-2009（木瓜蛋白酶），两个标准的内容基本一致。

1.2.3 结果计算 从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。样品的酶活力按下式计算：

1.3.1 溶剂

1.3.1.1 0.05mol/L磷酸氢二钠溶液 称取8.955g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）到500mL容量瓶，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀备用（加一滴甲苯防腐）。

1.3.1.2 酶缓冲液（现配现用） 称取0.528g L-半胱氨酸盐酸盐、0.2236g乙二胺四乙酸二钠（EDTA），用0.05mol/L磷酸氢二钠溶液分别溶解（共加入约90mL），合并混匀，用0.1mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L盐酸调pH＝6.0，定容到100mL。

1.3.1.3 酪蛋白溶液（现配现用） 称取0.600g酪蛋白（标准至0.001g），加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液80mL，60℃水搅拌溶解，用0.1mol/L盐酸调pH＝6.0，用纯水定容到100mL，（40±0.2）℃保温备用。

1.3.1.4 三氯乙酸溶液 称取2.994g乙酸钠，1.982g乙酸，1.798g三氯乙酸，用纯水分别溶解后混合，定容到100mL容量瓶中，摇匀备用。

1.3.1.5 待测酶溶液 称取待测木瓜蛋白酶适量（精确到0.001g），置100mL容量瓶中，加5mL酶缓冲液浸泡20min，加水至刻度，摇匀后，吸取1.0mL到25mL容量瓶中，加酶缓冲液至刻度，摇匀。

1.3.2 测试步骤

1.3.2.1 待测酶溶液的测试 量取1.0mL待测酶溶液置于具塞试管中，在（40±0.2）℃水浴锅中水浴10min，迅速加入酪蛋白溶液5.0mL，振荡使之充分混合后封口放回水浴，精确计时10min，加入三氯乙酸溶液5.0mL，立即摇匀，过滤。用纯水作为空白，在275nm下测定滤液的吸光度A1。

1.3.2.2 待测酶的空白测试 量取1.0mL待测酶溶液置于具塞试管中，在（40±0.2）℃水浴锅中水浴10min，迅速加入三氯乙酸溶液5.0mL，振荡使之充分混合后封口放回水浴，计时10min，加入酪蛋白溶液5.0mL，立即摇匀，过滤。用纯水作为空白，在280nm下测定溶液的吸光度A2。

1.3.2.3 酪氨酸标准液配制和测试 称取0.050g L-酪氨酸标准品（精确至0.001g）至1000mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶解并稀释到刻度（此为50μg/mL的标准液）。以纯水作空白，在280nm波长处测吸光度A3。

1.3.3 结果计算 试样中酶活力X1（u/g）按下式计算：

式（2）中：A1—待测酶溶液测试滤液的吸光度；A2—待测酶空白测试滤液的吸光度；A3—酪氨酸标准液的吸光度；n—待测酶样品的稀释倍数；m—待测酶样品的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 由所配制的酪氨酸稀释液测定的吸光度数据标准曲线

由标准曲线所得的回归方程为：Y=0.0077X，相关系数R=0.9979，经计算吸光常数k=130，符合实验要求。

2.2 两个标准测得的酶活力结果

对比表2和表3可以看出，在两个不同的标准下测定的酶活力值有着高达几十倍的差值。

表4 企业二的木瓜蛋白酶的酶活力结果

图1 酪氨酸溶液的标准曲线

表2 企业一提供的三种木瓜蛋白酶样品按国标测定的酶活力结果

表3 企业一提供的三种样品按其企标测定的酶活力结果

3 讨论

3.1 酪蛋白溶液配制方法的影响

国标中酪蛋白溶液配制完后其pH调节至7.5，而企业标准中的酪蛋白溶液是调节pH至6.0。可能是在pH为6.0条件下，酶活力较高。

3.2 反应条件的影响

国标中是在加入三氯乙酸后静置10min再进行过滤，这样蛋白质就基本完全除掉了，而企业标准中是加入三氯乙酸混匀后直接进行过滤，可能的结果就是蛋白质没有完全沉淀下来，这可能会导致测出酶活力值较大。

3.3 半胱氨酸盐酸盐的作用

企业标准中配制的酶缓冲液中含有半胱氨酸盐酸盐，这也是影响最后结果的一个重要原因。半胱氨酸是一种还原剂，它通过改变蛋白质分子之间和蛋白质分子内部的二硫键，减弱了蛋白质的结构，这样蛋白质就伸展开来，从而使酶分子更易作用于折叠的蛋白质肽键，使肽链更易被水解。

4 结论

目前对于动植物组织提取的蛋白酶制剂，国家还没有制定相应的标准，像蛋白酶制剂国标GB/T 23527-2009中明确规定该标准不适用于动植物组织提取的蛋白酶制剂。由于国家还没有制定相应的标准，就使动植物组织提取的蛋白酶制剂的酶活力测定没有依据可循，造成其市场比较混乱。

关于木瓜蛋白酶活力测定的标准，方焕[3]等人早就已经讨论过，他们比较讨论了木瓜蛋白酶的三种活性检测方法，结果表明，以酪蛋白为底物的紫外分光光度法操作简便、成本低廉，适于酶纯化过程中的活性比较和木瓜蛋白酶系列产品及国内商品酶的活性测定；以BAEE为底物的光学法反应稳定、重复性好，适于酶学性质的理论研究和出口商品酶的活性测定；以酪蛋白为底物的茚三酮显色法，虽然操作烦琐，但所需仪器简单，测定结果误差较小，非常适用于条件简陋的地区。本文中测定木瓜蛋白酶的活力均是采用上面的第一种方法，即以酪蛋白为底物的紫外分光光度法，正是由于这种方法操作简便、成本低廉，当前我国许多关于酶制剂的标准几乎都采用的是这种方法。

由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备，但是像木瓜蛋白酶这样的动植物组织提取的酶制剂也占据巨大的市场份额，因此国家有必要制定关于动植物组织提取的蛋白酶制剂的统一标准，以便人们能够在市场更加方便的进行质量检测。

[1]路英华.蛋白酶的研究进展[J].生物科学信息，1991，3（2）：8-10.

[2]凌奥汉，吴显荣.木瓜蛋白酶与番木瓜栽培[M].北京：中国农业出版社，1998：107.

[3]方焕，生吉萍，吴显荣.工业生产中木瓜蛋白酶的活性检测方法比较[J].食品与机械，2000（6）：27-29.

[4]GB/T 23527-2009中华人民共和国国家标准 蛋白酶制剂[S].

[5]Q/JWLSW 01-2007广西南宁杰沃利生物制品有限公司企业标准 木瓜蛋白酶[S].

[6]Q/NPB 01-2009广西南宁庞博生物工程有限公司企业标准木瓜蛋白酶[S].

Study on determination standards of papain activity

ZHANG Xing-can,CHEN Chao-yin,LI Ru-rong

（InstituteofBioresourceR&DofKunmingUniversityofScienceandTechnology-TsinghuaUniversity,Kunming650224,China）

The determination standards of enzyme activity of papain got from two companies depended on National standards and Enterprise standards was studied respectively，found that the results had great differences.Then possible reasons were analyzed，the main influential factors may be pH of substrate，reaction conditions and cysteine hydrochloride.

papain；determination of enzyme activity；standard

TS207.2

A

1002-0306（2011）10-0435-03

2010－10－08 * 通讯联系人

张兴灿（1987-），男，在读硕士，研究方向：生物技术制药。

云南省科技计划项目（2009EB081）。