包秋华，陈永福，张家超，孙志宏，包艳，张和平

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018)

一种快速定性和定量检测发酵乳中L.fermentum的方法

包秋华，陈永福，张家超，孙志宏，包艳，张和平

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018)

通过比对发酵乳杆菌（L.fermentum）与其他乳酸菌的16S rRNA基因序列的异同，设计出L.fermentum的种属特异性引物，应用此引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱和实时荧光定量PCR图谱分析，建立一种快速检测发酵乳中L.fermentum的定性和定量测定方法。

乳酸菌；发酵乳杆菌；PCR；实时荧光定量PCR

0 引言

目前对多菌复合的发酵乳样本中发酵乳杆菌(L.fermentum)的定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法[1-5]，传统生理生化方法易受选择培养基、培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限[1]。乳酸菌活菌数量是评价活性乳酸菌制品质量的重要指标[3,6-8]，平板菌落计数法是微生物学中最常见、最标准的一种活菌计数方法，但操作繁琐，耗时费力，对乳酸菌培养还需要厌氧装置[6]。与传统的理化鉴定和平板定量方法相比，16S rDNA基础上的PCR和实时荧光定量PCR方法检测乳酸菌更加快速，而且特异性和敏感性更强[1,4-5,7,9-10]。其中Dickson曾采用种属特异性引物成功定性分析了临床医学样本的L.fermentum[1]。本文设计种属特异性引物利用PCR和RT-PCR技术建立了一种快速定性、定量检测发酵乳中L.fermentum的方法。

1 实验

1.1 菌种和样本来源

标准菌株L.fermentum 1.1880，L.rhamnosus 1.2134，L.plantarum 1.2437，标准菌株L.acidophilus ATCC 4356，L.casei ATCC393；L.fermentum F6为本实验室从酸奶中分离得到具有益生特性的发酵乳杆菌[2,11]。传统发酵乳酸奶样（25#和36#）为本实验室于2009年从西藏采的自然发酵乳样品。

1.2 主要试剂

载体pMD-18T，Taq DNA polymerase，DNase I，反转录和实时定量的试剂盒（SYBRPrimeScriptTMRT-PCR Kit，DRR063A，包括：DRR037S和DRR 041A）；Trizol试剂盒。

1.3 主要仪器

PTC-200梯度PCR仪，ND-1000型微量紫外分光光度计，Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR仪，美国MP FastPrep-24快速核酸提取仪。

2 方法

2.1 引物的设计

从Genbank中下载L.fermentum不同菌株及其他乳酸菌标准株的16S rDNA序列，然后利用DNAStar中MegAlign进行序列比对，寻找种内保守区域，利用Primer 5.0进行引物设计，并通过GenBank中Blast检测引物特异性，获得L.fermentum的特异种引物。引物序列如下：上游引物LFf：5’-ATGGTGCTTGCACCTGATTG-3’，下游引物LFr：5’-ACTACCAGGGTAT CTAATC C-3’，预计扩增片断长度为746 bp；引物由上海桑尼有限公司合成。

2.2 L.fermentum 1.1880的16S rDNA基因的克隆

采用CTAB法和冻融法[12]提取L.fermentum 1.1880的基因组DNA，DNA纯化后取约100 ng DNA做PCR反应的模板。反应体系25.0 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，共2.5 μL 5 mmol/L上下游引物（LFf和LFr），0.3 μL 5 U/μL Taq酶，用二次蒸馏水补足至25.0 μL。PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性40 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环40次；72℃延伸8 min。PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测。然后将L.fermentum 1.1880的PCR产物纯化后与pMD-18T连接并转化DH5感受态细胞，经蓝白斑筛选、PCR、酶切分析等方法检测获得阳性克隆子pFT[13]。

2.3 外标准品的制备

提取以含有目的扩增片断的质粒pFT总DNA，紫外分光光度计测定A值后，计算出拷贝数，做10倍系列稀释，梯度稀释至109～102拷贝数/μL的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应。

2.4 样本的RNA提取和反转录

按Trizol试剂盒（Invitrogen）说明书提取样品RNA，然后用DNase I处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA。反转录扩增按大连宝生物工程有限公司（TaKaRa Code:DRR037S）说明书进行，反转录扩增反应条件：42℃反应15 min；85℃变性5 s，在温度-20℃下保存。

2.5 实时荧光定量PCR和定量反应系统特异性评定

以待测样品cDNA和外标准品为模板，用L.fermentum种特异性引物进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR反应参数：95℃变性25 s，95℃变性25 s，60℃退火22 s，40个循环。通过标准曲线和相应的计算机软件实现发酵乳中L.fermentum的快速定量检测。

绘制融解曲线的范围从70℃缓慢升温至95℃，温度每升高0.5℃读一次荧光值，由IQ5 Real-Time PCR仪自动绘制融解曲线。

3 结果与分析

3.1 快速定性检测L.fermentum

取L.fermentum和其他乳杆菌采用PCR方法检测引物的特异性并定性检测发酵乳中的L.fermentum，样本经L.fermentum的种属特异性引物扩增，在746 bp处出现预期特征条带时，表明含有L.fermentum，若在预期的位置没有检测到特征条带，则表明此样品中不含L.fermentum，其中部分结果如图1所示。图1中，7～10为L.fermentum外的其他种乳酸菌，结果为阴性，说明引物特异性好，与预期结果一致。泳道5～6为从西藏采的自然发酵乳样本，没有预期特征条带出现，说明这2个样本中没有L.fermentum。

图1 发酵乳杆菌的引物特异性验证及样本的定性检测

图1中，M为DL2000 Marker；1为pFT作为阳性对照；2为dH2O作阴性对照；3为L.fermentum 1.1880；4为L.fermentum F6；5为酸奶样25#（从西藏采的传统发酵乳）；6为酸奶样36#（从西藏采的自然发酵乳）；7为L.casei ATCC393；8为L.rhamnosus 1.2134；9为L.acidophilus ATCC 4356；10为L.plantarum 1.2437。

3.2 L.fermentum的快速定量检测方法的建立

以不同拷贝数的阳性模板pFT的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct值)为纵坐标得到L.fermentum的标准曲线。由图2可见，Ct值和拷贝数呈线性关系，荧光定量PCR标准曲线方程：Y=-3.392X+39(Y为Ct值，X为初始模板量的对数)，初始浓度与Ct值之间线性相关系数R2为0.991，斜率为－3.392。R2＞0.9表明所建立的L.fermentum标准曲线符合Real-Time PCR定量的要求。取L.fermentum F6的发酵豆乳15 h的乳样进行实时荧光定量PCR，经与标准曲线对比计算后为7.3±0.4 g-1。

图2 实时荧光定量检测发酵乳杆菌的标准曲线

4 结论

本文利用生物信息学方法设计L.fermentum种特异性引物，采用PCR和Real-Time PCR绝对定量技术成功建立了发酵乳中L.fermentum的快速定性和定量检测方法，此技术具有特异性强、重复性好、准确、快速等优点，并已经申请专利。定性分析的关键是特异性引物的设计和PCR条件的摸索；绝对实时荧光定量分析的关键是标准品的制备，本文选择含有荧光定量PCR扩增片段克隆到质粒中回收质粒，构建了含有目的条带的重组质粒作为标准品，实验证实可靠易行。实验过程中还发现，若利用绝对定量分析样本中活菌的数量当提取RNA时最好采用核酸提取仪破碎原始样本中的细胞，比液氮研磨法获得RNA多，不易降解，大大提高准确率。

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A rapid qualitative and quantitative detection method of L.fermentum in the fermented milk

BAO Qiu-hua,CHEN Yong-fu,ZHANG Jia-chao,SUN Zhi-hong,BAO Yan,ZHANG He-ping
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education ministry Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot Inner Mongolia 010018,China)

The differences in 16S rRNA gene region between L.fermentum and other Lactic acid bacteria were compared.The species specificity primer of L.fermentum was designed and used to carry out species-specific PCR assay and fluorescent quantitative real-time PCR.Through analyzing the electrophoretic pattern and the curve of RT-PCR,a rapid qualitative and quantitative method for the detection of L.fermentum in the fermented milk was established.

Lactic acid bacteria;L.fermentum;Species-specific PCR;Real-Time PCR

TS252.7

A

1001-2230（2011）02-0059-03

2010-10-08

973计划前期研究专项(2010CB134502)；教育部创新团队发展计划(IRT0967)；国家自然科学基金项目（No.30760156）。

包秋华（1973-），女，助理研究员，研究方向为乳品微生物。

张和平