刘峰，张晓波，任红波，金海涛，马文琼，孟利

（1.黑龙江省农科院农产品质量安全研究所，农业部谷物及制品质量监督检验测试中心，哈尔滨150086；2.黑龙江大学生命学院，哈尔滨150080）

梯度淋洗/离子色谱法测定婴儿乳粉中硝酸盐

刘峰1，张晓波1，任红波1，金海涛1，马文琼1，孟利2

（1.黑龙江省农科院农产品质量安全研究所，农业部谷物及制品质量监督检验测试中心，哈尔滨150086；2.黑龙江大学生命学院，哈尔滨150080）

婴儿乳粉中含有丰富的营养物质，存在干扰硝酸盐分析的未知成分。采用梯度淋洗方式将其与硝酸盐进行分离，达到了准确测定的目的。分析过程中采用乙酸溶液沉淀乳乳粉中蛋白，过滤后用RP柱去除样品中的脂类物质。净化后，直接将试样注入离子色谱仪分析，淋洗液由自动发生器产生，外标法定量。稳定性实验5次进样硝酸盐的峰面积平均值为0.2961 μS·min（RSD为0.35%），保留时间平均值为26.721 min（RSD为0.23%）。组分添加回收率分别为99.04%和99.43%，相对偏差（RSD）分别为1.85%和1.02%。

婴儿乳粉；硝酸盐；梯度淋洗；离子色谱

0 引言

硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于自然环境中，硝酸盐往往表现为亚硝酸盐的毒性。亚硝酸盐与亚硝胺的形成有关，动物试验中被证实为致癌物。婴儿乳粉中的营养成分不同于普通乳粉，其中加入了丰富的营养物质，这些营养物质经常对分析造成干扰。采用等度离子色谱法测定婴儿乳粉中的硝酸盐解决不了乳粉中存在干扰的问题，将影响硝酸盐分析的干扰物质有效分离，不能准确测定，也可能造成假阳性判定。分析采用EG40发生器自动生成KOH梯度淋洗液，淋洗过程中先采用较低浓度的淋洗液进行淋洗，将婴儿乳粉中的干扰物质与硝酸盐分离，然后采用较高浓度淋洗液净化分析系统。方法简单、易行，且灵敏度、准确度高，重现性好，能够满足实际样品的测定需要[1-2]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ICS-3000离子色谱仪，色谱工作站为Chromeleon 6.80中文版，配有RFIC-30淋洗液自动发生装置。所用阴离子标准储备液(质量浓度1 000 mg/L)采用优级纯配制。所有用水均为电阻率18.3 MΩ的去离子水。

在启动仪器后，平衡时间一般不少于15 min。为获得良好的基线，可以先用较高的浓度较高OH-淋洗液（浓度为30～50 mmol/L）进行淋洗，然后再通过较低浓度的OH-淋洗液（浓度为5～10 mmol/L）平衡系统。抑制器为连续自动再生膜阴离子抑制器，仪器工作条件如表1所示。

表1 仪器主要工作条件

1.2 标准溶液的配制

硝酸钠于101～103℃烘箱内烘干2 h，在保干器内冷却至室温。准确称取干燥后的硝酸钠0.068 5 g于烧杯中，加少量水溶解。滴加10滴氢氧化钾溶液（浓度为1.0 mol/L）后转移定容于50 mL容量瓶内，混匀。该标准溶液于4℃保存，有效期为3个月。此溶液中硝酸盐的质量浓度为1 000 mg/L。标准工作溶液用去离子水依次逐级稀释，低于质量浓度100 mg/L的标准溶液需要当天配制。硝酸盐标准中间液：20.0 g/L，硝酸盐标准工作液为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg/L；该标准溶液现用现配，硝酸钠（NaNO3，纯度＞99.5%）[3]。

图1 标样的NO3-色谱

1.3 优化梯度淋洗液条件

采用EG40发生器自动发生成OH淋洗液，自动发生器可在线产生无游离碳酸的淋洗液，泵在整个过程中只输送去离子水，淋洗液的浓度是由电流和流速控制的，使梯度混合的精确度提高，去除了机械混合中易造成的误差。淋洗液为氢氧化钾溶液，浓度为4.0～60 mmol/L。洗脱梯度为4 mmol/L淋洗33 min，60 mmol/L淋洗8 min,4 mmol/L淋洗5 min，如表2所示。

1.4 RP柱的活化

在使用Dionex OnGuard RP柱前，需按以下步骤对其进行活化后方可处理样品：用5 mL甲醇活化Dionex OnGuard RP小柱，推动速度每分钟不超过3 mL；用10 mL去离子水冲洗RP小柱，推动速度每分钟不超过3 mL；将小柱平放20 min；将5 mL样品缓慢推入小柱，推动速度每分钟不超过3 mL，弃去前3 mL。收集2 mL样品，稀释进样或直接进样。Dionex OnGuard RP小柱可反复使用，每次使用前按照上述步骤重新活化即可，活化时可以通过固相萃取装置进行，施加正压和负压均可，但在处理过程中不可使RP柱的填料暴露于空气中。如重新活化后，柱填料颜色不褪去，则应改换小柱。

1.5 样品的处理与样品的净化

称取1.0g婴儿乳粉样品，将其置于100 mL容量瓶中，加入约80 mL去离子水，摇匀。用超声波超声提取30 min，加入3.0%冰乙酸水溶液2 mL，定容，放入4℃冰箱中冷却20 min。过滤时将上层清液倒入滤纸过滤，尽量减少摇动，避免下层沉淀的蛋白质进入滤纸中，滤液备用。样品过滤净化时，取过滤液15 mL通过0.22 μm水性滤膜针头滤器、RP柱，弃去前面3 mL收集后面洗脱液待测。

2 结果与讨论

2.1 提取及分离条件的选择

表2 梯度淋洗液条件

婴儿乳粉中含有丰富的蛋白质，测定前必须将其去除，否则会造成色谱柱污染。方法包括以下几种：乙腈去除法、沉淀剂去除法，而使用的沉淀剂又为乙酸锌加亚铁氰化钾和冰乙酸两种。使用乙腈去除蛋白时，如果取样品4 mL则加入5 mL乙腈，加入的乙腈会起到很好的去除蛋白的效果。但是抑制器需要使用外加水模式，在这种模式下外加水依靠外加氮气将其压出，气压控制需要比较精确，实际操作比较困难。而采用乙酸锌加亚铁氰化钾除蛋白法则是分别加入约20%的乙酸锌和10%的亚铁氰化钾，两种沉淀剂在电导检测器都会有很高的电导值相应，影响电导检测器的使用寿命。加入冰乙酸产生的电导值较低，去除蛋白效果好，因此本试验选用冰乙酸作为除蛋白的沉淀剂[4]。

分离过程中的流动相采用EG发生器自动生成OH淋洗液，如OH的浓度高，硝酸盐的出峰时间提前，反之则延后。如选取OH为4 mmol/L，则出峰时间约26 min，取OH为6 mmol/L，出峰时间约22 min，OH为8 mmol/L，出峰时间约18 min，选择更高的OH会造成EG中KOH的浪费。婴儿乳粉中的有机酸类丰富，选择高浓度的OH可减少分析时间，但是选择过高的OH-淋洗液可能存在有机酸干扰，造成分离硝酸盐和有机酸不能完全分离，影响结果的判定[5]。

2.2 仪器的稳定性和重现性

取婴儿乳粉样品1份，添加浓度为2.0 mg/L的硝酸盐，然后按样品分析方法处理，每隔2 h进行一次分析。0～8 h内共进行进样分析5次，硝酸盐峰面积的平均值为0.2961μS·min（RSD为0.35%），保留时间平均值为26.721min（RSD为0.23%），结果表明样品经处理后8h内进样对样品测定结果无明显影响。

2.3 线性范围、回归方程和检出限

用硝酸盐标准中间液配制标准工作液，质量浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg/L，分别对5个质量浓度的标准系列工作液进样，峰面积（Y）与溶液质量浓度（X）进行线性回归分析，标准曲线的回归方程为Y=1.0115 X-0.081，R2=0.9997。表3为标准样品分析结果。由表3，根据信噪比S/N=5，测得硝酸盐的检出限为0.8 mg/kg。

表3 标准样品分析结果

2.4 样品测定及回收率试验

称取乳粉样品1.0和2.0 g，加入10 mL去离子水，然后按照1.5节的处理方法，测定结果见表4，并同时进行回收试验，分别加入1.0和2.0 mg/kg硝酸盐标样，组分的平均回收率分别为99.04%和99.43%，RSD分别为1.85%和1.02%（n=5）。

表4 样品分析结果

3 讨论

离子色谱法分析阴离子的过程中采用的检测器为电导检测器，其对一切产生电导的物质都会有响应。而分析婴儿乳粉的过程中，由于乳粉中含有大量的营养成分，有可能存在干扰离子（有机酸等），其出峰时间与可能硝酸盐接近，国家标准测定方法中，淋洗液洗脱浓度较高，不能彻底排除干扰，可能造成假阳性误判。优化淋洗液中的KOH浓度并采用梯度洗脱的方式，使干扰离子与硝酸盐分离度增加，解决了干扰物质影响分析的问题。实现了等度淋洗离子色谱法不能准确测定婴儿乳粉中硝酸盐的问题，提高了灵敏度、分辨率和重现性，达到了快速测定婴儿乳粉中硝酸盐的目的。

[1] 牟世芬,刘克纳.离子色谱方法及应用[M]北京:化学工业出版社,2000.64-80.

[2] 孙明山,孙忠萍,牛朝红，等.离子色谱法对生活饮用水中氟、氯、硫酸根、硝酸根阴离子的测定[J].农业与技术，2007,4(2).:89-90.

[3] 顾文奎,刘肖.离子色谱法检测污水样品中无机阴离子[J].口岸卫生控制，2007,12(3):24-26.

[4] 刘峰,金海涛.离子色谱法同时测定饮用水中7种阴离子的研究[J].哈尔滨商业大学学报，2008(5):103-106.

[5] MURAD IHH,TAKASHIK.Ion Chromatogram Method for Nitrate and Nitrite in Human Saliva[J].JournalChromatogram，2000,744(2):433-437.

Determination of nitrate in infant milk powder using gradient elution/Ion chromatography

LIU Feng1,ZHANG Xiao-bo1,REN Hong-bo1,JIN Hai-tao1,MA Wen-qiong1MENG Li2
(1.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Institute for quality and safety of agricultural products，Ministry of A-griculture Grain and its Products Quality Supervision and Testing Center,Harbin 150086,China；2.College of Life Science,Heilongjiang University,Harbin 150080,China)

Infant milk powder is very rich in nutrients,there is interference with nitrate analysis of unknown composition.In this paper,gradient elution method separate it nitrate to the accurate determination of purpose.It was found that the solution of acetic acid for milk protein precipitation and filtration column followed by RP removal of lipid material samples.After purification,the sample directly was analyzed by the ion chromatograph,the volume of external standard.Stability test sample 5 times of the peak area nitrate average were 0.2961μS·min(RSD 0.35%),the average retention time was 26.721min(RSD 0.23%).Component recoveries were 99.04%and 99.43%,RSD were 1.85%and 1.02%.

Infant milk powder;Nitrate;Gradient elution;Ion chromatography

TS252.7

A

1001-2230（2010）01-0042-03

2010-07-08

黑龙江大学博士启动金项目。

刘峰（1976-），男，助理研究员，研究方向为农产品质量安全。

孟利