北京市延庆县疾病预防控制中心（102100）崔玉娟 任淑敏 苏东霞

2010年11月2日，北京市延庆县某小学出现了15例不明原因发热症状儿童病患，主要临床症状为发热（体温37.5℃以上）、咳嗽等。为查明疫情原因、制定有效的防治措施，及时控制、扑灭疫情并提供可靠的实验室数据，本县疾病预防控制中心应用实时荧光定量PCR技术对患者的咽拭子标本进行了甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、甲型H1N1流感病毒等亚型检测。

1 材料与方法

1.1 样本采集 用带有无菌聚丙烯纤维头及聚丙烯杆的拭子采集发病3天内的病例咽拭子12份，于4℃保存下运送到实验室进行检测。

1.2 主要试剂与仪器 QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit、AgPath-IDTm onestep RT-PCR Kit（美国ABI公司）、引物（fluA、fluB、H1、H3、swfluA、swH1、RNP由北京市CDC 提供）、QIAGENQIAvac 24 Plus（德国QIAGEN公司）、离心机（德国Sigma公司）、生物安全柜（上海东联）、AB 7500 fast PCR System（美国ABI公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样本预处理 将12份咽拭子在涡旋振荡器上充分震荡混匀，室温静置10min。

1.3.2 核酸提取 分别取200μl预处理好的标本依照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒说明书进行核酸提取，最后分别得到60μl样本核酸作为扩增模板。

1.3.3 核酸扩增 按照ABI公司的AgPath-IDTm one-step RTPCR Kit试剂盒说明书对12份核酸样本进行real-time RT-PCR扩增。选择FAM荧光检测模式。

1.3.4 结果判断 阴性对照：无扩增曲线，无CT值或0。阳性对照：有扩增曲线，CT值＜30。检测样本：样本有典型的扩增曲线且CT值≤37，报告样本阳性。见附表1。

2 结果

12份病例样本完成PCR扩增后，其扩增曲线显示：8份样本为fluA、RNP及H3同时阳性，1份样本七种引物探针核酸扩增均阴性，3份样本仅RNP引物探针核酸扩增阳性。见附表2、附图。

3 讨论

Real-time RT-PCR是将荧光共振能量转……