欧阳和中 江苏省丹阳市人民医院神经内科 丹阳 212300

李云 山东省济南市中心医院急诊科 济南 250013

EPO对全脑缺血后低氧诱导因子1α及存活素表达的调节

欧阳和中 江苏省丹阳市人民医院神经内科 丹阳 212300

李云 山东省济南市中心医院急诊科 济南 250013

[目的]研究促红细胞生成素对全脑缺血再灌注大鼠缺氧诱导因子1α和凋亡相关蛋白存活素的调节，探讨其抗凋亡的可能机制。[方法]将成年雄性SD大鼠75只按随机数字表法分为全脑缺血组(n=35)和全脑缺血EPO干预组(n=35),然后按再灌注时间不同又分为6h、12h、24h、48h、72h、5d和7d七个亚组。采用改良的Pu刘lsineli 4-VO法制作全脑缺血大鼠模型。应用TUNEL染色检测再灌注后不同时间点海马CA1区的神经元凋亡水平，免疫组织化学方法检测再灌注后不同时间点海马CA1区缺氧诱导因子1α和存活素表达水平的变化。[结果]全脑缺血EPO干预组24h至7d亚组TUNEL阳性神经元计数分别为1.50±0.73、3.14±0.88、5.78±1.03、7.78±1.79、10.34±1.82.与全脑缺血组相应时间点亚组相比明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。全脑缺血EPO干预组48h至5d亚组HIF-1α表达阳性细胞计数分别为11.26±0.02、20.28±2.03、3.33±0.04,与全脑缺血组相应时间点亚组相比明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).全脑缺血EPO干预组24h至5d亚组survivin蛋白表达阳性细胞计数分别为12.21±1.04、16.34±4.02、24.33±3.03、30.52±5.04,与全脑缺血组相应时间点亚组相比明显增高,差异均有统计学意义(P＜0.05)。[结论]在全脑缺血急性期，EPO抑制HIF-1α的表达而使存活素表达升高，具有一定的神经保护作用.

Global Cerebral Ischemia; hippocampus; Survivin;Erythropoietin; Hif-1α

促红细胞生成素（EPO）基因是缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）的下游基因。EPO具有神经保护作用，是近年来人们对这个神经体液因子新的认识，但其机制尚未明了。存活素(Survivin)是最近新发现的一种凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族成员。研究表明，在肿瘤的发生发展过程中，多种细胞因子如EGF等可通过HIF-1α途径上调survivin基因表达来阻止细胞凋亡。本实验大鼠对全脑缺血大鼠应用EPO，并检测HIF-1α、Survivin在此干预措施下表达水平的变化以及该变化对缺血后神经细胞凋亡的影响，通过研究这些变化之间的相关性，来探讨全脑缺血后EPO抗凋亡神经保护的可能机制。

1.材料和方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠75只，体重315±20g，由山东大学实验动物中心提供；促红细胞生成素（商品名：益比奥）购于沈阳三生制药股份有限公司；Survivin 多克隆抗体(鼠抗) 购于Santa Cruz公司HIF-1α多克隆抗体（兔抗）购于武汉博士德公司；细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Apoptosis Detection Kit Ⅰ, POD)、多聚赖氨酸、DAB显色试剂盒由武汉博士德公司提供。SP通用型试剂盒（sp-9000）（试剂盒组成包括：3%H2O2去离子水、封闭用正常山羊血清工作液、生物素化二抗工作液、辣根酶标记链霉卵蛋白素工作液）：购于北京中山金桥生物技术开发有限公司。powerlab多导电生理系统、Chart5分析软件：ADInstruments，澳大利亚，由山东大学医学院生物医学工程教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将成年雄性SD大鼠75只按随机数字表法分为全脑缺血组(n=35)和全脑缺血EPO干预组(n=35),然后按再灌注时间不同又分为6h、12h、24h、48h、72h、5d和7d7个亚组。

1.2.2 动物模型制作 采用改良的Pulsinelli[1]四血管阻断法制作大鼠全脑缺血再灌注模型。大鼠术前24h禁食，自由饮水。经10%的水合氯醛（300～350mL/kg）麻醉后,俯卧位固定,于颈后正中切长约2cm的切口,显露第1颈椎双侧的翼孔,插入双极电凝针,电凝双侧椎动脉使之完全闭合,缝合伤口,置笼喂养,自由饮食。24h后同法麻醉,仰卧位固定,颈前正中线切长约2cm切口,暴露双侧颈总动脉, 于头皮下插入针状电极,动态监测脑电变化，然后用微型无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉,以出现静息脑电波为判定大鼠全脑缺血的标准，10min后放开动脉夹,恢复血液供应,缝合伤口。假手术组动物仅灼烧双侧椎动脉,但不夹闭双侧颈总动脉,其余步骤同上。

1.2.3 给药方法 GI+EPO组中，全脑缺血10分钟取下动脉夹后，立即给予EPO腹腔注射（4000U/kg/day），其中6h、12h和1d亚组只在缺血后给予一次EPO治疗，2d亚组第二天再给予一次同样剂量的EPO治疗，3d、5d和7d亚组第二天和第三天分别再给予一次同样剂量的EPO治疗。全脑缺血组每天给予等剂量生理盐水腹腔注射。假手术组不给予干预措施。

1.2.4 标本获取 将大鼠在相应的时间点用10%水合氯醛麻醉后，沿正中线剪开胸腔，将连接着灌注管的粗针头从心尖部插入左心室，再入升主动脉，用大止血钳固定针头，先用4℃肝素化0.1M的PBS溶液200ml迅速冲净脑内血液，再用4℃0.1M的PBS-4%多聚甲醛溶液400ml灌注固定30分钟，大剪刀断头，放于冰盒上，迅速分离脑组织（注意保持脑组织完整性）置于0.1M的PBS -4%多聚甲醛溶液中后固定24小时，然后放入30%蔗糖溶液中脱水直至脑组织沉至瓶底。 冰冻切片机（-20℃）自视交叉后2.2mm处向后连续冠状切片,染色。

1.2.5 TUNEL染色标记凋亡细胞 用计算机图像仪软件Image Pro Plus处理TUNEL染色片，计算海马CA1区TUNEL阳性神经细胞（核）数。

1.2.6 免疫组织化学（SP法）检测海马CA1区HIF-1、survivin阳性细胞计数 用SP法进行CA1区HIF-1α、survivin免疫组化，切片在400倍视野下进行海马CA1区CA1区HIF-1α与survivin阳性细胞计数。每张切片海马CA1 区任选5个视野,对CA1区HIF-1 α与survivin阳性细胞计数,计算出该切片的平均CA1区HIF-1α与survivin阳性细胞数。

2.结 果

（一）、TUNEL染色

GI组再灌注后24小时后TUNEL阳性细胞明显增加，24小时、48小时、72小时、5天、7天亚组与Sham组相比有统计学差异（p<0.05）；

GI+EPO组再灌注48小时后，TUNEL阳性细胞才有明显增加。48小时、72小时、5天、7天亚组细胞数与Sham组相比有显著差异（p<0.05）。

配对t检验

在相应的24小时、48小时、72小时、5天、7天的时间点亚组，GI+EPO组的TUNEL细胞数目比GI组的明显少，具有统计学意义（p<0.05）（表1）。

表1 各组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞数( x±s, 个) (40×10)P=0.0001

（二）、缺氧诱导因子1α的表达（表2）

表2 各组大鼠海马CA1区HIF－1α阳性细胞数(个, x±s)Tab2 Expression of HIF－1α protein(number of positive cells) in the CA1 area of hippocampus from sham group、GI group and GI+EPO group

GI组再灌注12 h后在海马CA1区中可见HIF-1α表达增加, 3 d 达高峰,后逐渐下降；与Sham组比较GI组24 h、3 d、5 d、7 d亚组的HIF-1α的表达均明显升高，具有统计学意义( P<0.05)（图1）。

图1.缺血再灌注3d HIF-1α表达达高峰（×400）Fig.1 the expression of HIF-1α peaked at 72h in ischemia/reperfusion group（×400）

GI+EPO组再灌注后12h也可见HIF-1α的表达开始增加, 也在 3 d时达高峰，5 d、7 d明显下降。与GI组相比, 24 h、2 d、3 d、5 d 亚组HIF-1α的表达显著降低，具有统计学意义( P<0.05)，12 h亚组HIF-1α的表达水平稍低于GI组，计算无统计学意义（P>0.05）（图2）。

图2 治疗组3d亚组HIF-1α表达明显低于缺血再灌注（×400）Fig.2 the expression of HIF-1α was obviously lower in 3d subgroups of treatment group than that in model group（×400）

存活素的表达（表3）

表3 免疫组织化学染色显示各组大鼠海马CA1区Survivin表达阳性细胞数(个, x±s)Tab3:Expression of Survivin protein(number of positive cells) in the CA1 area of hippocampus from sham group、GI group and GI+EPO group

在假手术组大鼠海马CA1区中极少见阳性表达。

GI组在再灌注6h～48h极少见到阳性表达，72h后在海马CA1区中可见Survivin少量表达, 7 d 达高峰, 与Sham组比较GI组72 h、5 d、7 d亚组的Survivin的表达均明显升高，具有统计学意义(P<0.05) ;

图3 缺血再灌注7d survivin表达达高峰（×400）Fig.3 the expression of survivin peaked at 7d in ischemia/reperfusion group（×400）

GI+EPO组再灌注后6 h、12 h极少见到阳性表达，24h即见Survivin的高表达,之后随时间延长,其表达明显增加,5d 时达高峰，7d时稍下降。与GI组相比, 再灌注后24 h、48 h、72 h、5 d 时Survivin的表达显著升高，具有统计学意义( P<0.05)，且表达时间及高峰提前。7d亚组survivin表达水平稍高于GI组，计算无统计学意义（P>0.05）。

图4 缺血再灌注5d survivin表达达高峰（×400）Fig.4 the expression of survivin peaked at 5d in ischemia/reperfusion group（×400）

3.讨 论

全脑缺血缺氧常发生在临床常见的各种休克、心脏骤停、哮喘持续状态、CO中毒等之中，由于脑细胞的能量供应主要来源于糖有氧代谢，几乎没有能量储备，因此脑组织对缺血缺氧十分敏感，尤其是大脑皮质（第3、4层）和海马神经元。新近有实验研究表明，大鼠全脑缺血12分钟再灌注3天时，海马CA1区的神经元有92%发生凋亡[2]。

细胞凋亡[3]由基因表达调控，其过程纷繁复杂。目前已发现了众多促凋亡基因如p53、p21、caspase、bcl-2等；同时也相应存在一些抗凋亡基因[4]，如促红细胞生成基因、EPO编码基因、血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1,Flt-1)的编码基因等。而以上基因均由缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）调控表达。研究表明，严重脑缺血缺氧后HIF-1的活化形式HIF-1α的过量表达的促神经细胞凋亡作用远大于其神经保护作用。

Survivin作为IAP家族成员之一，能够通过促进组织微血管生成[5、6、7]、抑制天冬氨酸特异性的半胱氨酸酶(cysteine proteinases with specificity for aspartic acid residues, caspase)的表达[8、9、10]而发挥强大的抗凋亡作用。如何降低缺血性脑血管病脑组织中Hif-1α及其下游促凋亡基因的过度表达、提高survivin等抗凋亡因子的表达而起到脑保护作用，是目前研究的热点之一，如日本学者Okazaki等尝试了给予大脑中动脉梗死的小鼠模型注射骨髓基质细胞来提高survivin的表达，结果显示有一定效果[11]。而有研究发现，全脑缺血后应用EPO干预处理可降低HIF-1的下游促凋亡基因rtp-801等的表达。

HIF-1α与survivin在缺血缺氧环境下的表达具有相关性，目前在恶性肿瘤的研究中已得到大量的验证。Hongzhen Zhang等在对人食道鳞状上皮细胞癌的研究中发现HIF-1α与survivin协同表达，在肿瘤的恶性程度、临床分期及远端转移等起到重要作用[12]。

Edward M.Conway[13]等研究观察到缺氧相关的存活素mRNA表达水平的增加在HIF-1α基因敲除的胚胎干细胞低氧培养中更加显著。这个结果通过对几组相同环境下的ES细胞克隆进行实验而确认，提示HIF-1α在缺氧条件下可能直接也可能间接地抑制了存活素的表达。

因此本研究应用EPO治疗干预全脑缺血模型，检测HIF-1α与survivin表达的变化，表明应用EPO可显著延迟并较少全脑缺氧再灌注后海马神经元的凋亡；与之相对应的，应用EPO后，24 h、2 d、3d、5 d 亚组HIF-1α的表达显著降低，而24h、48h、72h、5 d时Survivin的表达显著升高，表明HIF-1α与Survivin的表达具有相关性，并能够被EPO所调控。

由此推论，EPO可能通过反馈抑制严重脑缺氧后HIF-1α的过度表达而解除了对survivin表达的抑制来发挥抗凋亡作用。

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EFFECT OF ERYTHROPOIETIN ON HIF-1α、SURVIVIN FOLLOWING GLOBAL CEREBRAL ISCHEMIA IN RATS

Ouyang He Zhong(Department of neurology,Danyang people’s Hospital of Jiangsu province,Danyang 212300 ,Jiangsu,China)

Objective

To observe the effects of EPO on the Hif-1α、survivin expression after global cerebral ischemiareperfusion in rats,exploring its antiapoptosis mechanisms.

Methods

The experimental GI model was established by 4-vessel occlusion method and confirmed successfully by an electroencephalogram (EEG).Seventy-nine adult male Sprague–Dawley rats were randomly divided into sham group (n=5), global cerebral ischemia group(GI, n=35) and global cerebral ischemia + EPO treatment group (GI+EPO, n=35)，and the two latter groups to seven subsets each with 5 rats.

EPO were administered to rats in GI+EPO group by abdominal cavity injection (4000u/ kg /day)one time a day with the same dosage in the first 3 days.

The cerebral hippocampus tissues were obtained 3 days after sham operation in sham group and 6、12 hours、1、2、3、5 and 7 days after reperfusion in the GI and GI +EPO groups for determining apoptosis of cells by TUNEL and the expressions of Hif-1α、survivin proteins by Immunohistochemistry staining method.

All the data in this study were expressed as mean±standard deviation (SD).A value of P<0.05 was considered statistically significant.

Results

TUNEL staining

Compared to the sham group, the number of apoptotic cells in subset 1、2、3、5、7d of GI group and subset 2、3、5、7d of GI+EPO group were significantly increased.

The number of apoptotic cells in subset 1、2、3、5、7d of GI+EPO group were significantly less than of GI group.

Immunohistochemistry staining

Expression of Hif-1α

Compared to the sham group Hif-1αimmunopositive cells were significantly increased in the injured hippocampus in 1、2、3、5、7 d subsets of GI group(P<0.01) and GI+EPO group.

Compared to the corresponding subsets of GI group，expression level of survivin in subsets 1、2、3、5d of GI+EPO were significantly higher.Expression of survivin

Compared to the sham group survivin immunopositive cells were significantly increased in the injured hippocampus in 3、5、7 d subsets of GI group(P<0.01) and in 1、2、3、5、7d subsets of GI+EPO group.

Compared to the corresponding subsets of GI group，expression level of survivin in subsets 1、2、3、5d of GI+EPO were significantly higher.EPO significantly decreased the expression of Hif-1αand increased the expression of survivin(P<0.05), and decreased significantly the number of apoptotic cells compared to GI group(P<0.05).Conclusion

Rivalry to the overexpression of Hif-1αby EPO can induce overexpression of survivin, which might be one of the mechanisms in inhibiting neuronal apoptosis by EPO in the hippocampus after GBI.

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.04.075

全脑缺血再灌注 ；海马；存活素；促红细胞生成素；缺氧诱导因子－1α