李爱峰，孙爱玲，柳仁民，吕 慧

(1.聊城大学化学化工学院，山东聊城252059;2.聊城高级财经职业学校(第一校区)，山东聊城252059)

高效液相色谱
——发光散射测定甜菊糖中甜菊糖苷和菜鲍迪苷A的含量

李爱峰1，孙爱玲1，柳仁民1，吕 慧2

(1.聊城大学化学化工学院，山东聊城252059;2.聊城高级财经职业学校(第一校区)，山东聊城252059)

建立了高效液相色谱－蒸发光散射分离与检测甜菊糖中甜菊糖苷和莱鲍迪苷A的实验方法。色谱分离使用Kromasil NH2柱(250mm×4.6mm，i.d.，5μm)，流动相为85%乙腈水溶液，柱流出物采用蒸发光散射检测器检测，漂移管温度为85℃，空气做载气，流速为2.4L/min。甜菊糖苷和莱鲍迪苷A的线性范围分别为0.05～3.0、0.05～3.7mg/mL，平均加标回收率分别为97.63%、99.25%，相对标准偏差分别为1.04%、1.27%。该方法简单、快速、准确、重现性好，适用于甜菊糖中甜菊糖苷和莱鲍迪苷A的定量分析。

甜菊糖，甜菊糖苷，莱鲍迪苷A，高效液相色谱，蒸发光散射检测

甜菊糖是从菊科植物甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的叶子中提取的一种天然甜味剂，具有高甜度、低热量、安全无毒等特点，是一种可替代蔗糖的非常理想的甜味剂［1］。甜菊糖主要含有甜菊糖苷(stevioside，SS)、莱鲍迪苷A(rebaudioside A，RA)、莱鲍迪苷 C(rebaudiosideC，RC)、莱鲍迪苷 D(rebaudioside D，RD)、二糖苷(steriolbioside，SB)等八种成分［2］。在这八种成分中有经济价值的为前四种，其中RA是甜味品质最好的成分，含量仅占25%左右，而含量占60%～70%的SS严重影响着甜菊糖的味质［3］。因此，建立一种准确、简单、快速的甜菊糖组分分离分析方法具有重要的意义。从二者的结构式(如图1所示)可以看出，由于RA和SS具有相同的母核结构，差别仅在于葡萄糖基数目的不同，因此二者的极性相近，难以用常规手段分离。目前，文献报道的分离方法有毛细管电泳法［4］、高效液相色谱法［5］、薄层色谱法［6］等，其中高效液相色谱氨基柱法由于其方法简便、准确而被广泛采用，由于RA和SS的紫外最大吸收波长为195nm，使用紫外检测器灵敏度很低。蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)是一种新型的质量型检测器，特别适用于无生色团、无紫外吸收或紫外末端吸收的组分的检测。本实验使用氨基柱对RA和SS进行了分离，使用ELSD进行了检测，运用外标法对于甜菊糖中二者的含量进行了测定，该法简便、快速、重现性好，适用于甜菊糖中RA和SS的定量分析。

表1 RA和SS的回归方程、线性范围和检出限

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜菊糖样品、SS、RA标准品 由某精细化工厂提供;甲醇 济南试剂总厂;乙腈 色谱纯，禹城化工厂;实验用水 为自制去离子水。

Unimicro HPLC泵及色谱工作站 通微(上海)分析技术有限公司;Attech ELSD2000ES蒸发光散射检测器 美国奥泰公司。

1.2 色谱分离与检测条件

色谱柱:Kromasil NH2柱(250mm×4.6mm，i.d.，5μm，大连江申分离科学技术公司);流动相:乙腈－水(85∶15，V/V);流速:1.0mL/min;进样量:20μL;柱温:室温;漂移管温度:85℃;空气流速:2.4L/min，分流阀状态:开。

1.3 对照品溶液的制备

准确称取SS和RA对照品各50mg，用甲醇溶解后定量转移至100mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，该溶液作为标准储备溶液。准确移取上述溶液1、2、3、4、5mL分别置于10mL容量瓶中，用流动相定容，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，取续滤液备用，作为对照品溶液。

1.4 供试品溶液的制备

精确称取甜菊糖样品适量，置于50mL容量瓶中，加入适量流动相振荡至完全溶解，用流动相定容，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

为了选择合适的色谱柱，实验考察了RA和SS在C18柱、C30柱和氨基柱上的分离情况，结果表明二者在C18柱和C30柱上几乎没有保留，在氨基柱上有较强的保留，可能是由于多个葡萄糖单元的存在使得分子具有强极性所致。使用氨基柱考察了流动相的组成对于分离效果的影响，结果表明乙腈－水作为流动相的分离效果明显优于甲醇－水。使用乙腈－水作为流动相的分离效果如图2所示，当乙腈∶水=80∶20(V/V)时，SS与干扰组分分离效果不好;当乙腈∶水=85∶15(V/V)时，SS与干扰组分达基线分离，时间也令人满意;如果继续增加乙腈的比例，保留时间太长，峰展宽严重。

图2 流动相的组成对分离效果的影响

2.2 ELSD参数的选择

漂移管的温度和载气的流速影响检测器的响应，漂移管的温度升高，流动相蒸发趋于完全，噪音减小，信噪比提高，但温度过高则会使流动相沸腾，噪音增大，甚至会导致组分部分汽化，响应值变小;载气的流速越小，流动相蒸发后形成的溶质颗粒越大，散射光的强度越大，响应值越大，但流速太小会使流动相蒸发不完全，噪音增大，信噪比降低。分别改变漂移管的温度和载气的流速，观察噪音和响应信号的大小，发现当漂移管的温度为85℃，载气的流速为2.4L/min，分流阀开时，信噪比最高。

2.3 线性关系考察

分别取不同浓度的对照品溶液20μL进样分析，由色谱工作站处理数据，以质量浓度的对数为横坐标，以峰面积的对数为纵坐标作图，用最小二乘法进行线性回归，得SS与RA的线性回归方程和相关系数，并以信噪比等于3为标准，测得SS与RA的检出限，见表1。

2.4 精密度实验

配制RA和SS的混合对照品溶液，连续进样5次，每次20μL，分别测得峰面积，按照外标法定量，计算各组分浓度的相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)分别为1.05%和0.97%，表明该法精密度良好。

2.5 稳定性实验

配制RA和SS的混合对照品溶液，每隔4h进样分析一次，连续进样6次，每次20μL，分别测得峰面积，按照外标法定量，计算各组分浓度的RSD分别为0.65%和0.37%，表明样品在24h内稳定。

2.6 回收率实验

在已知RA和SS含量的甜菊糖样品中加入一定量的SS和RA标准品，混合均匀后进样分析，平行测定5次，按照外标法定量并计算回收率，结果见表2。如表2所示，RA和SS的回收率均接近100%，表明该方法准确可靠。

2.7 样品测定结果

使用该方法对市售的甜菊糖样品中RA和SS的含量进行了测定，结果见表3。

表2 样品加标回收率

表3 样品测定结果

3 结论

本文建立了HPLC－ELSD测定SS和RA的实验方法，对实验条件进行了优化，并进行了方法学考察和实际样品的测定，结果表明该法稳定、准确、快速，适用于甜菊糖中SS和RA的含量测定。

［1］娄力行.甜菊糖及其衍生物的研究进展［J］.中国糖料，2008(2):70－72.

［2］张亚雄，胡为民，胡滨.甜菊糖中A3甙分离方法初探［J］.中国食品添加剂，1998(4):48－49.

［3］朱海霞，郑建仙.甜菊糖的酶法改性［J］.中国食品添加剂，2004(1):54－60.

［4］刘露露，顾正荣，饶琴.毛细管电泳检测低热量食品中甜菊糖甙的含量［J］.食品研究与开发，2009，30(4):113－116.

［5］赵永良，崔媛，刘景彬，等.高效液相色谱法测定甜菊糖甙中莱鲍迪甙A［J］.食品科技，2009，34(9):294－296.

［6］陈慕英，于喜水，孙玉华，等.甜菊甙类的研究［J］.中医药信息，2001，18(3):23－24.

Separation and identification of stevioside and rebaudiodside A in stevia by high performance liquid chromatography－evaparative light scattering detector

LI Ai－feng1，SUN Ai－ling1，LIU Ren－min1，LV Hui2
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China;2.Liaocheng Senior Financial Vocational School(No.1 Campus)，Liaocheng 252059，China)

A high performance liquid chromatography method for separation and determination of stevioside(SS)and rebaudiodside A(RA)in stevia was established.The analytical column was Kromasil NH2(250mm×4.6mm，i.d.，5μm).The mobile phase was acentonitrile－water(85∶15，V/V).The samples were determined by an evaparative light scattering detector.The drift tube temperature was kept at 85℃ and the flow rate of atmosphere was 2.4L/min.The calibration curves had good linearity in the range of 0.05～3mg/L for SS and 0.05～3.7mg/L for RA.The average recoveries of SS and RA were 97.63%(n=5，RSD=1.04%)and 99.25%(n=5，RSD=1.27%)，respectively.The method was a convenient，rapid and effective method for qualitatively analysis of SS and RA in stevia.

stevia;stevioside;rebaudiodside A;high performance liquid chromatography;evaparative light scattering detector

TS207.3

A

1002－0306(2011)04－0373－03

2010－04－28

李爱峰(1978－)，女，硕士研究生，讲师，研究方向:分离科学。

聊城大学科研基金资助项目(X081007)。